Mirin

Mirin inhibe la activación de ATM inducida por DSB, la fosforilación dependiente de ATM de los objetivos posteriores Nbs1 y Chk2, y la autofosforilación de ATM en Ser1981 dependiente de MRN en respuesta a los DSB. Este compuesto también inhibe el punto de control G2 en las células TOSA4, y la reparación del ADN dependiente de la homología en las células HEK293. [1]

En células con HPV16 integrado (SiHa), sensibiliza los episomas de HPV a PA25, lo que resulta en una reducción de ~5 veces de la IC50 de PA25. [2]

El pretratamiento con este químico también disminuye la viabilidad celular e inhibe la expresión del antígeno nuclear de células proliferantes en células de riñón embrionario humano 293 tratadas con cisplatino. [3]

Mirin en nanopartículas resultó en un fuerte deterioro del crecimiento tumoral, asociado con la activación de DDR, la acumulación de p53 y la muerte celular.

• Ensayo de nucleasa

  Las reacciones con sustratos de oligonucleótidos no en horquilla contienen 25 mM de MOPS (pH 7.0), 60 mM de KCl, 0.2% de Tween 20, 2 mM de DTT, 1 mM o 5 de MnCl₂ (o 5 mM de MgCl₂, o 5 mM de CaCl₂), 0.1 pmol de sustrato de ADN y 0.3 pmol de Mre11 (o una cantidad equivalente de Mre11 complejizado con Rad50) en un volumen de 10 μl, y se incuban a 37 °C durante 30 min. Luego se añaden SDS, EDTA y proteinasa K a concentraciones finales de 0.2%, 5 mM y 0.1 mg/ml, respectivamente, y se incuban durante otros 15 min. 4 μl de cada reacción se mezclan con 4 μl de tampón de carga de formamida y luego se cargan en un gel de secuenciación que contiene 10% de acrilamida y 7 M de urea. Después de la corrida, cada gel se analiza utilizando un sistema de fosforimágenes. Las reacciones que contienen sustratos en horquilla son idénticas a las que contienen sustratos no en horquilla, excepto que se añaden 3 pmol de este compuesto a las reacciones como se indica, y las reacciones se incuban a temperatura ambiente durante la noche. Las reacciones de unión de extremos no homólogos contienen 25 mM de MOPS (pH 7.0), 60 mM de KCl, 0.2% de Tween 20, 2 mM de DTT, 4 mM de MgCl₂, 2 mM de MnCl₂, 0.5 mM de ATP, 4 ng de ADN plasmídico, 10% de polietilenglicol, 0.01 pmol de ADN ligasa I humana y 0.06 pmol de este químico o 0.1 unidades de exonucleasa III de E. coli (GIBCO-BRL), en un volumen de 10 μl. Después de la incubación a 37 °C durante 25 min, se añade Tween 20 a una concentración final de 0.5%, y una alícuota de 2.5 μl se amplifica mediante PCR utilizando los cebadores DAR5 y DAR147. Los productos de PCR se clonan utilizando el kit de clonación TA y se secuencian utilizando un analizador genético capilar ABI automatizado.

• Líneas celulares

  HEK 293 cells

• Concentraciones

  100 μM

• Tiempo de incubación

  24 h

• Método

  Human embryonic kidney (HEK) 293 cells are maintained in RPMI-1640 supplemented with 5% heat-inactivated fetal bovine serum, penicillin (100 U/mL), and streptomycin (100 mg/mL) in humidified air with 5% CO₂ at 37 °C. Cells are given fresh medium at 48 h intervals. The cells are seeded in 96-well plates in regular growth medium. Cells are pretreated with mirin (100 μM for 1 h before the cisplatin (20 μM) treatment followed by incubation for 8 and 24 h. The MTT assay is performed using the EZ-Cytox cell viability assay kit according to the manufacturer's protocol and MTT reduction is measured at a 450 nm wavelength using a micro-plate reader.