IOX1

IOX1 aumenta los niveles de H3K9me3 en células HeLa a través de la inhibición de KDM4A sin un efecto significativo en la viabilidad celular. Este compuesto muestra una menor eficacia en células HeLa debido a su baja permeabilidad celular, mientras que el derivado n-octil éster mejora su permeabilidad celular. [1]

• Ensayo AlphaScreen

  Todos los reactivos se diluyen en 50 mM HEPES, 0,1% BSA, pH 7,5 suplementado con 0,01% Tween20 y se dejan equilibrar a temperatura ambiente antes de añadirlos a las placas. Los ensayos de recambio catalítico se realizan en volúmenes de 10 μL en placas de 384 pocillos de bajo volumen a TA. La reacción consistió en enzima (5 nM), péptido sustrato biotinilado (30 nM), Fe(II) (1 μM), ascorbato (100 μM), 2OG (10 μM) y se realizó a TA. Para PHD2, la reacción consistió en enzima (5 nM), péptido sustrato biotinilado (60 nM), Fe(II) (20 μM), ascorbato (200 μM), 2OG (2 μM) y se realizó a TA. Se utiliza EDTA para detener la reacción (5 μL), se añaden perlas donadoras (conjugadas con estreptavidina) y aceptoras (conjugadas con proteína A) de AlphaScreen preincubadas con anticuerpos de producto peptídico (5 μL). Las placas se sellan con papel de aluminio para protegerlas de la luz, se incuban a temperatura ambiente durante 60 minutos y se leen en un lector de placas PHERAstar FS utilizando un conjunto de filtros de excitación/emisión AlphaScreen 680/570. La concentración final de perlas en la reacción de 20 μL es de 20 μg/mL. Los valores de IC50 se calculan en Prism 6 después de la normalización frente a los controles de DMSO correspondientes.

• Líneas celulares

  HeLa cells

• Concentraciones

  ~300 μ M

• Tiempo de incubación

  24 hours

• Método

  Antiproliferative activities of compounds are determined by the MTT assay. HeLa cells are seeded into 96-well plates and cultured at 37 °C for 24 h to achieve 70%. Subsequently, the medium is replaced with DMEM medium containing the tested compounds in different concentrations of 1-300 μM in 1% DMSO. Staurosporine in 0.03-10 μM final concentration is used as a control for cytotoxicity. After 24 h of treatment, the medium is replaced with CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent and incubated for 4 hours. CC50 values are calculated in Prism 6 software after normalisation against corresponding 1% DMSO treated cells and 1% DMSO in media (no cells) controls.