GSK343

GSK343 inhibe la trimetilación de H3K27 (H3K27me3) con una IC50 de 174 nM en células de cáncer de mama HCC1806. Este compuesto inhibe potentemente la proliferación celular en células de cáncer de mama y células de cáncer de próstata, y la línea celular de cáncer de próstata LNCaP es la más sensible a él, con una IC50 de 2,9 μM. [1]

Este químico suprime significativamente el crecimiento de células EOC cultivadas en matriz extracelular (ECM) de matrigel 3D, que imita el microambiente tumoral in vivo. Además, también induce la apoptosis de células EOC en 3D e inhibe significativamente la invasión de células EOC. [2]

GSK343, un inhibidor selectivo de EZH2, inhibe la fagocitosis.

• Ensayos bioquímicos in vitro contra Histone Methyltransferase

  La actividad contra EZH2 se evalúa utilizando un complejo PRC2 de 5 miembros (Flag-EZH2, EED, SUZ12, AEBP2, RbAp48). El protocolo del ensayo se puede resumir de la siguiente manera: se preparan soluciones madre de compuestos de 10 mM a partir de sólidos en 100% de DMSO. Se prepara una placa maestra de dilución en serie de 11 puntos en formato de 384 pocillos (dilución 1:3, las columnas 6 y 18 fueron controles de DMSO de volumen igual) y se dispensa en placas listas para el ensayo utilizando tecnología de dispensación acústica para crear un sello de 100 nL de compuesto y controles de DMSO. Las adiciones al ensayo consistieron en adiciones de volumen igual de 10 nM de EZH2 y la solución de sustrato (5 Tµg/mL de nucleosomas de HeLa y 0,25 TµM de [³H]-SAM) dispensadas en las placas de ensayo utilizando un dispensador combi multidrop. Las placas de reacción se incuban durante 1 hora y se apagan con una adición de volumen igual de 0,5 mg/mL de perlas de imagen PS-PEI (RPNQ0098) que contienen 0,1 mM de SAM no marcado. Las placas se sellan, se adaptan a la oscuridad durante 30 minutos y se adquiere una imagen de luminiscencia de punto final de 5 minutos utilizando un generador de imágenes Viewlux. Las estadísticas de la placa, como Z’ y la relación señal/fondo, así como las curvas de dosis-respuesta, se analizan utilizando Activity BaseXE. La actividad bioquímica in vitro de EZH1 se evalúa como parte de un complejo PRC2 de 5 miembros utilizando un ensayo SPA de 384 pocillos idéntico a EZH2. Los componentes del tampón, la dispensación de reactivos, la preparación de la placa de compuestos, las condiciones de extinción y el análisis de datos son idénticos para EZH1 y EZH2 con concentraciones finales de ensayo de 20 nM de EZH1, 5 TµM/mL de nucleosomas de HeLa y 0,25 TµM de [³H]-SAM. El análisis de datos adicional, los pivotes de pIC50 y las visualizaciones son posibles gracias a TIBCO Spotfire. Este compuesto se perfila en Reaction Biology Corp. (Malvern, PA) para evaluar la inhibición en su panel de ensayos de Histone Methyltransferase. La actividad de la metiltransferasa se evalúa utilizando la tecnología HotSpot, un ensayo de unión por filtro miniaturizado basado en radioisótopos. Los inhibidores se disuelven en dimetilsulfóxido (DMSO) y se prueban a concentraciones de hasta 100 uM con una concentración final de DMSO del 2%. El tampón que contiene la metiltransferasa a la concentración indicada y su sustrato preferido, como se muestra en la tabla adjunta, se preincuba con esta sustancia química durante 10 minutos. Las reacciones se inician mediante la adición de 1 uM de S-adenosil-L-[metil-³H]metionina (SAM), se incuban durante 60 minutos a 30 °C y luego se transfieren a papel de filtro P81 y se lavan con PBS antes de la detección.

• Líneas celulares

  Breast cancer cell lines (HCC1806, Sk-Br-3, ZR-75-1), prostate cancer cell lines (DU145, PC3, LNCaP)

• Concentraciones

  ~50 μM

• Tiempo de incubación

  6 days

• Método

  To account for varying doubling rates among cancer cell lines, the optimal cell seeding is determined empirically for all cell lines by examining their growth in a 384-well plate over 6 days with a wide range of seeding densities. Cells are then plated at the optimal seeding density and allowed to adhere overnight. Cells are treated in duplicate with a 20-point 2-fold dilution series of this compound or 0.147% DMSO (vehicle control) and incubated for 6 days at 37C in 5% CO2. Cells are then lysed with 25 μl CellTiter-Glo per well and chemiluminescence is quantified with a TECAN Safire2 microplate reader. In addition, an untreated plate of cells is harvested at the time of compound addition (T0) to quantify the starting number of cells. CTG values after 6 days of treatment were expressed as a percent of the T0 value and plotted against compound concentration. Data are fit with a 4-parameter equation to generate a concentration response curve and the concentration of compound required to inhibit 50% of growth (gIC50) is determined