GSK2606414

Este compuesto inhibe la autofosforilación de PERK en células A459 con una IC50 de <0,3 μM. [1]

GSK2606414 exhibe una alta disponibilidad oral y un aclaramiento sanguíneo de bajo a moderado en ratones, ratas y perros. Este compuesto, administrado por vía oral, inhibe el crecimiento tumoral de manera dosis-dependiente en ratones portadores de tumores pancreáticos humanos BxPC3. [1]

• Ensayo de la quinasa del retículo endoplasmático similar a PKR (PERK) (formato HTRF)

  El dominio citoplasmático de GST-PERK se adquiere. La eIF2α humana de longitud completa con 6-His se purifica a partir de la expresión de baculovirus en células de insecto Sf9. La proteína eIF2α se intercambia de tampón por diálisis en PBS, se modifica químicamente con NHS-LC-biotina y luego se intercambia de tampón por diálisis en 50 mM Tris, pH 7.2, 250 mM NaCl, 5 mM DTT. La proteína se alícuota y se almacena a −80 °C. La solución de extinción se prepara fresca y, cuando se añade a la reacción, da concentraciones finales de 4 nM de anticuerpo eIF2α fosfo-ser51, 4 nM de IgG anti-conejo marcado con Eu-1024, 40 nM de estreptavidina Surelight APC y 15 mM de EDTA. Las reacciones se realizaron en placas negras de poliestireno de 384 pocillos de bajo volumen en un volumen final de 10 μL. El volumen de reacción contiene, en concentraciones finales, 10 mM HEPES, 5 mM MgCl₂, 5 μM ATP, 1 mM DTT, 2 mM CHAPS, 40 nM de eIF2α 6-His biotinilado y 0,4 nM de GST-PERK. Los compuestos bajo análisis se disuelven en DMSO a 1,0 mM y se diluyen en serie 1-3 con DMSO a través de 11 diluciones. Se transfiere una cantidad de 0,1 μL de cada concentración al pocillo correspondiente de una placa de ensayo. Esto crea un rango de concentración final del compuesto de 0,00017 a 10 μM. Se añade la solución de GST-PERK a las placas de ensayo que contienen los compuestos y se preincuban durante 30 min a temperatura ambiente. La reacción se inicia con la adición de ATP y la solución de sustrato de eIF2α. Después de 1 h de incubación, se añade la solución de extinción. Las placas se cubren durante 2 h a temperatura ambiente antes de la determinación de la señal. La señal resultante se cuantifica en un lector Viewlux. La señal de APC se normaliza a la señal de europio transformando los datos mediante un cálculo APC/Eu. Los datos para las curvas de respuesta a la concentración se representan como % de inhibición calculado con la fórmula de reducción de datos 100 × [1 – (U1 – C2)/(C1 – C2)] frente a la concentración del compuesto, donde U es el valor desconocido, C1 es el valor de control promedio obtenido para 1% de DMSO y C2 es el valor de control promedio obtenido para 0,1 M de EDTA. Los datos se ajustan con una curva descrita por , donde A es la respuesta mínima, B es la respuesta máxima, D es el factor de pendiente, x es la concentración del compuesto y C es la IC50. Los resultados para cada compuesto se registran como valores de IC50.

• Líneas celulares

  A549 cells

• Concentraciones

  0.3 μM

• Tiempo de incubación

  2 h

• Método

  Cells were incubated with PERK inhibitor (GSK2606414, compound 38) and then stimulated with thapsigargin. After 2 h, the cells were lysed and analyzed for inhibition of PERK autophosphorylation.

• Modelos animales

  BxPC3 human pancreatic xenograft model

• Dosificaciones

  ~150 mg/kg

• Administración

  Oral administration