Omipalisib (GSK2126458)

Los compuestos se diluyen en serie (3 veces en 100% DMSO) en una placa madre de polipropileno de 384 pocillos desde la columna 1 hasta la columna 12 y desde la columna 13 hasta la columna 24, para obtener 11 concentraciones para Omipalisib (GSK2126458). Las columnas 6 y 18 solo contienen DMSO. Una vez realizadas las titulaciones, se transfieren 0,05 μL a una placa de ensayo de bajo volumen de 384 pocillos. Esta placa de ensayo contiene tres controles farmacológicos (inhibidores de PI3K conocidos) y 3 controles de ensayo: (1) Enzima sin inhibidor; (2) Tampón sin enzima, y (3) Tampón sin enzima más PIP3 nativo. El DMSO se estampa en todos los pocillos de las columnas 6 y 18. El PIP3 se añade a 40 μM en 1X tampón de reacción (1 μL de 200 μM PIP3) a filas alternas de la columna 18 (pocillos 18 B, D, F, H, J, L, N, P). Las reacciones de control sin enzima se realizan en los pocillos 18 A, C, E, G, I, K, M, O (0,1 μL de 100% DMSO). El ensayo de perfilado de PI3-Kinasa se optimiza utilizando el kit HTRF. El kit de ensayo contiene siete reactivos: 1) Tampón de reacción 4X; 2) PIP2 nativo (sustrato); 3) Stop A (EDTA); 4) Stop B (Biotin-PIP3); 5) Mezcla de detección A (Estreptavidina-APC); 6) Mezcla de detección B (Anti-GST marcado con Eu más dominio PH marcado con GST); 7) Mezcla de detección C (KF). El tampón de reacción de PI3Kinasa se prepara diluyendo el stock 1:4 con agua desionizada. El DTT recién preparado se añade a una concentración final de 5 mM el día de uso. La adición de enzima y la pre-incubación del compuesto se inician con la adición de 2,5 μL de PI3K (al doble de su concentración final) en 1X tampón de reacción a todos los pocillos usando un Multidrop Combi. Las placas se incuban a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las reacciones se inician con la adición de 2,5 μL de solución de sustrato 2X (PIP2 y ATP en 1X tampón de reacción) usando un Multidrop Combi. Las placas se incuban a temperatura ambiente durante una hora. Las reacciones se detienen con la adición de 2,5 μL de solución de parada (Stop A y Stop B premezclados en una proporción de 5:1, respectivamente) a todos los pocillos usando el Multidrop Combi. Las reacciones detenidas se procesan para detectar la formación del producto añadiendo 2,5 μL de Solución de Detección a todos los pocillos usando el Multidrop Combi (Mezcla de detección C, Mezcla de detección A y Mezcla de detección B combinadas en una proporción de 18:1:1, es decir: para un volumen total de 6000 μL, mezclar 5400 μL de Mezcla de detección C, 300 μL de Mezcla de detección A y 300 μL de Mezcla de detección B. Nota: esta solución debe prepararse 2 horas antes de su uso). Después de una hora de incubación en la oscuridad, la señal HTRF se mide en el lector de placas Envision configurado para una excitación de 330 nm y detección de doble emisión a 620 nm (Eu) y 665 nm (APC).

BT474, HCC1954 and T-47D cells

0-1 μM

72 hours

BT474, HCC1954 and T-47D (human breast) are cultured in RPMI-1640 containing 10% fetal bovine serum at 37 °C in 5% CO₂ incubator. Cells are split into T75 flask two to three days prior to assay set up at density which yields approximately 70-80% confluence at time of harvest for assay. Cells are harvested using 0.25% trypsin-EDTA. Cell counts are performed on cell suspension using Trypan Blue exclusion staining. Cells are then plated in 384 well black flat bottom polystyrene in 48 μL of culture media per well at 1,000 cells/well. All plates are placed at 5% CO₂, 37 °C overnight and Omipalisib (GSK2126458) is added the following day. One plate is treated with CellTiter-Glo for a day 0 (t=0) measurement and read as described below. This compound is prepared in clear bottom polypropylene 384 well plates with consecutive two fold dilutions. 4 μL of these dilutions are added to 105 μL culture media, after mixing the solution, 2 μL of these dilutions are added into each well of the cell plates. The final concentration of DMSO in all wells is 0.15%. Cells are incubated at 37 °C, 5% CO₂ for 72 hours. Following 72 hours of incubation with it each plate is developed and read. CellTiter-Glo reagent is added to assay plates using a volume equivalent to the cell culture volume in the wells. Plates are shaken for approximately two minutes and incubated at room temperature for approximately 30 minutes and chemiluminescent signal is read on the Analyst GT reader. Results are expressed as a percent of the t=0 and plotted against the compound concentration. Cell growth inhibition is determined for this compound by fitting the dose response with a 4 or 6 parameter curve fit using XLfit software and determining the concentration that inhibits 50% of the cell growth (gIC50) with the Y min as the t=0 and Y max as the DMSO control. Value from wells with no cells is subtracted from all samples for background correction.

Human BT474 tumors implanted in mice.

≤300 μg /kg

Administered via p.o.