GSK-J4 Hydrochloride

GSK J4 HCl is an ethyl ester derivative of the JMJD3 selective histone demethylase inhibitor GSK-J1 with an IC50 value greater than 50 μM in vitro. This compound is used to probe the consequences of demethylation of H3K27me3. In human primary macrophages, this chemical inhibits the lipopolysaccharide-induced production of cytokines, including pro-inflammatory tumour necrosis factor (TNF). In addition, it prevents the lipopolysaccharide-induced loss of H3K27me3 associated with the TNF transcription start sites and blocked the recruitment of RNA polymerase II. [1]

GSK-J4 hydrochloride is a potent dual inhibitor of H3K27me3/me2-demethylases JMJD3/KDM6B and UTX/KDM6A. It inhibits LPS-induced TNF-α production in human primary macrophages. This compound is a cell permeable prodrug of GSK-J1.

• Histone Demethylase AlphaScreen

  La inhibición de las histona demetilasas se evalúa utilizando el ensayo AlphaScreen de histona demetilasa (Amplified Luminescence Proximity Homogenous Assay). Este ensayo utiliza un péptido sustrato biotinilado y se basa en la detección de la marca metilo del producto mediante un anticuerpo específico acoplado a perlas aceptoras de proteína A y una perla donante de Estreptavidina para capturar el péptido. En resumen, las enzimas demetilasas recombinantes se incuban en presencia de Fe2+ en forma de sulfato ferroso amónico (FAS), α-cetoglutarato (KG) y péptido sustrato biotinilado. Se incluye ácido L-ascórbico para proporcionar un ambiente reductor y prevenir la oxidación de Fe2+. Después de la incubación con el péptido sustrato, la presencia del producto se detecta mediante la tecnología AlphaScreen. Los ensayos AlphaScreen de demetilasa se realizan en formato de placa de 384 pocillos utilizando proxiplacas blancas. Todos los pasos se llevan a cabo en tampón de ensayo (50 mM HEPES pH 7.5, 0.1% (p/v) BSA y 0.01 % (v/v) Tween-20). El FAS se disuelve fresco cada día en 20 mM HCl a una concentración de 400 mM y se diluye a 1.0 mM en agua desionizada. Todos los demás componentes se disuelven frescos cada día en agua desionizada. Para las determinaciones de IC50, se transfieren 5 μL de tampón de ensayo que contiene la enzima demetilasa a los pocillos de una proxiplaca de 384 pocillos. Se transfieren titulaciones de este compuesto (0.1 μL) a cada pocillo y se permite que las enzimas preincuben durante 15 minutos con esta sustancia química (la concentración final de DMSO es del 1%). La reacción enzimática se inicia añadiendo 5 μL de una mezcla de sustratos que consiste en α-KG, FAS, ácido L-ascórbico y péptido sustrato biotinilado, y la reacción se incuba durante el tiempo indicado a temperatura ambiente. La reacción enzimática se detiene después del tiempo indicado añadiendo 5 μL de EDTA (concentración final de 7.5 mM en tampón de ensayo). Las perlas donantes de Estreptavidina (0.08 mg/ml) y las perlas aceptoras conjugadas con Proteína A (0.08 mg/ml) se preincuban durante 1 hora con un anticuerpo para la marca metilo del producto y la presencia del producto biotina-H3 se detecta añadiendo 5 μL de las perlas AlphaScreen preincubadas (concentraciones finales de 0.02 mg/ml con respecto a las perlas aceptoras y donantes). La detección se permite proceder durante 1 hora a temperatura ambiente y las placas de ensayo se leen en un lector de placas BMG Labtech Pherastar FS. Los datos se normalizan al control sin enzima y la IC50 se determina a partir del ajuste de la curva de regresión no lineal utilizando GraphPad Prism 5.

• Líneas celulares

  Mouse podocytes

• Concentraciones

  5 μM

• Tiempo de incubación

  48 h

• Método

  Cells were serum starved for 4 hours, followed by treatment with EPZ-6438 (10 μM) or this compound (5 μM) for 48 hours.

• Modelos animales

  BALB/c mice

• Dosificaciones

  10 mg/kg

• Administración

  i.p.