DAPT

Se utilizan células de riñón embrionarias humanas (American Type Culture Collection CRL-1573), transfectadas con el gen para APP751 (HEK 293) para ensayos rutinarios de reducción de Aβ. Las células se siembran en placas de 96 pocillos y se dejan adherir durante la noche en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor. DAPT se diluye a partir de soluciones madre en dimetilsulfóxido (DMSO) para obtener una concentración final igual a 0,1% de DMSO en el medio. Las células se pretratan durante 2 horas a 37 °C con este compuesto, se aspiran los medios y se aplican soluciones frescas del compuesto. Después de un período de tratamiento adicional de 2 horas, se retira el medio condicionado y se analiza mediante un ELISA sándwich (266–3D6) específico para Aβ total. La reducción de la producción de Aβ se mide en relación con las células de control tratadas con 0,1% de DMSO y se expresa como un porcentaje de inhibición. Los datos de al menos seis dosis por duplicado se ajustan a un modelo logístico de cuatro parámetros utilizando el software XLfit para determinar la potencia. Los cultivos neuronales humanos y de ratón PDAPP se cultivan en medios sin suero para mejorar sus características neuronales, y parecían ser más del 90% neuronas después de la maduración antes de su uso. Los medios condicionados para establecer los valores basales de Aβ se recolectan añadiendo medios frescos a cada pocillo e incubando durante 24 horas a 37 °C en ausencia de este químico. Las culturas se tratan luego con medios frescos que contienen este compuesto en el rango deseado de concentraciones durante 24 horas adicionales a 37 °C, y se recolectan los medios condicionados. Para la medición de Aβ total, las muestras se analizan con el mismo ELISA (266–3D6) que se utiliza para los ensayos de células HEK 293. Los análisis de muestras para la producción de Aβ42 se realizan mediante un ELISA separado (21F12–3D6) que utiliza un anticuerpo de captura específico para el C-terminal de Aβ42. La inhibición de la producción de Aβ total y Aβ42 se determina por la diferencia entre los valores del tratamiento con el compuesto y los períodos basales. Después de graficar el porcentaje de inhibición versus la concentración de este compuesto, los datos se analizan con el software XLfit, como se indicó anteriormente, para determinar la potencia.

SK-MES-1

2.5 μM to 160 μM

72 hours

Cells are seeded into 96-well plates and exposed to 0.1% DMSO or DAPT at concentrations in the range of 2.5 μM–160 μM for 72 hours. Cytotoxicity is determined with 3-(4, 5)-dimethylthiahiazo-(-z-y1)-3, 5-di-phenytetrazoliumromide (MTT) dye reduction assay with minor modifications. Briefly, after incubation with this compound, 20 μL MTT solution (5 mg/mL in PBS) is added to 180 μL medium in each well and plates are incubated for 4 hours at 37 °C, and subsequently 150 μL DMSO is added to each well, and mixed by shaking at room temperature for 15 minutes. Absorption is measured by an enzyme-linked immunosorbent assay at 490 nm to determine absorbance values. α-MEM supplemented with the same amount of MTT solution and solvent is used as blank solution. The IC50 value is calculated using PROBIT program in SPSS.

Heterozygous PDAPP transgenic mice overexpressing the APPV717F mutant form of the amyloid precursor protein.

≤100 mg/kg

Administered via p.o.