Cyclosporin A

La Cyclosporin A se une a la ciclofilina (inmunofilina) en las células T[1], forma un complejo ciclina-este compuesto que se une e inhibe la calcineurina. [2] Este químico inhibe la calcineurina con una IC50 de 7 nM[3], luego bloquea la translocación nuclear de NF-AT. [4] También afecta a las mitocondrias al evitar que el MTP (poro de transición de permeabilidad mitocondrial) se abra con una IC50 de 39 nM. [5]

Cyclosporin A es un agente inmunosupresor eficaz después de la administración parenteral u oral en ratones, ratas y cobayas. [6], se utiliza clínicamente en trasplantes de órganos para prevenir el rechazo. [7]

• Ensayo phosphatase

  Se adquieren calcineurina y calmodulina de cerebro bovino purificadas. Las mezclas de reacción con enzima purificada contienen 100 nM de calcineurina, 100 nM de calmodulina y 5 μM de fosfopéptido marcado con ³²P, en 60 μl (volumen total) de tampón de ensayo que contiene 20 mM de Tris (pH 8), 100 mM de NaCl, 6 mM de MgCl₂, 0,5 mM de ditiotreitol, 0,1 mg de albúmina de suero bovino por ml, y bien 0,1 mM de CaCl₂ o 5 mM de EGTA. Las mezclas de reacción con lisados celulares contienen 20 μl de lisado sin diluir, 5 μM de fosfopéptido marcado con ³²P y 40 μl de tampón de ensayo. Cuando se indica, las mezclas de reacción contienen 50 μM de péptido 412 o 413 y/o 500 nM de ácido okadaico, un inhibidor específico de las fosfatasas 1 y 2A; 500 nM de ácido okadaico son suficientes para la inhibición de las fosfatasas independientes de Ca²⁺, mientras que concentraciones más altas inhiben parcialmente también la actividad dependiente de Ca²⁺. Después de 15 min a 30°C, las reacciones se terminan con la adición de 0,5 ml de tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) que contiene 5% de ácido tricloroacético. El fosfato inorgánico libre se aísla por cromatografía de intercambio catiónico Dowex y se cuantifica por recuento por centelleo como se describe.

• Líneas celulares

  Jurkat cells (clone J77)

• Concentraciones

  ~100 nM

• Tiempo de incubación

  1 hr

• Método

  Immunosuppressive agents are dissolved in ethanol at concentrations 1000-fold more than the concentration desired for cell treatments. Cells (10⁶) are suspended in 1 ml of complete medium in microcentrifuge tubes; 1 μl of ethanol or of the ethanolic solution of Cyclosporin A is added, and the cells are incubated at 37°C for 1 hr. Cells are washed twice with 1 ml of PBS on ice and lysed in 50μl of hypotonic buffer containing 50 mM Tris (pH 7.5); 0.1 mM EGTA; 1 mM EDTA; 0.5 mM dithiothreitol; and 50 μg of phenylmethylsulfonyl fluoride, 50 μg of soybean trypsin inhibitor, 5 μg of leupeptin, and 5 μg of aprotinin per ml. Lysates are subjected to three cycles of freezing in liquid nitrogen followed by thawing at 30°C and then are centrifuged at 4°C for 10 min at 12,000×g.

• Modelos animales

  Rat

• Dosificaciones

  45 mg/kg

• Administración

  orally