Crizotinib hydrochloride

El PF-2341066 muestra una potencia similar contra la fosforilación de c-Met en células epiteliales de ratón mIMCD3 o caninas MDCK con un IC50 de 5 nM y 20 nM, respectivamente. El PF-2341066 muestra una actividad mejorada o similar contra las células NIH3T3 diseñadas para expresar los mutantes del sitio de unión al ATP de c-Met V1092I o H1094R o el mutante del bucle P M1250T con un IC50 de 19 nM, 2 nM y 15 nM, respectivamente, en comparación con las células NIH3T3 que expresan el receptor de tipo salvaje con un IC50 de 13 nM. En contraste, se observa un cambio marcado en la potencia de PF-2341066 contra las células diseñadas para expresar los mutantes del bucle de activación de c-Met Y1230C e Y1235D con un IC50 de 127 nM y 92 nM, respectivamente, en comparación con el receptor de tipo salvaje. El PF-2341066 también previene potentemente la fosforilación de c-Met en las células NCI-H69 y HOP92, con un IC50 de 13 nM y 16 nM, respectivamente, que expresan las variantes endógenas de c-Met R988C y T1010I, respectivamente. El PF-2341066 es >1.000 veces selectivo para las RTK VEGFR2 y PDGFRβ, >250 veces selectivo para IRK y Lck, y ~40 a 60 veces selectivo para Tie2, TrkA y TrkB, todo en comparación con c-Met. El PF-2341066 es 20 a 30 veces selectivo para las RTK RON y Axl. En contraste, el PF-2341066 muestra un IC50 casi equivalente de 24 nM contra la variante de fusión oncogénica de la ALK RTK, nucleofosmina (NPM)-anaplastic lymphoma kinase (ALK), expresada por la línea celular de linfoma anaplásico de células grandes humano (ALCL) KARPAS299. El PF-2341066 inhibe los fenotipos neoplásicos dependientes de c-Met de las células cancerosas y los fenotipos angiogénicos de las células endoteliales. El PF-2341066 suprime el crecimiento de las células de carcinoma gástrico humano GTL-16 con un IC50 de 9,7 nM. El PF-2341066 induce la apoptosis en las células GTL-16 con un IC50 de 8,4 nM. El PF-2341066 inhibe la migración e invasión de las células de carcinoma pulmonar humano NCI-H441 estimuladas por HGF con un IC50 de 11 nM y 6,1 nM, respectivamente. El PF-2341066 inhibe la dispersión de células MDCK con un IC50 de 16 nM. El PF-2341066 previene la fosforilación de c-Met estimulada por HGF, la supervivencia celular y la invasión de Matrigel con un IC50 de 11 nM, 14 nM y 35 nM, respectivamente. Además, el PF-2341066 previene la tubulogénesis de ramificación de HMVEC estimulada por suero (formación de tubos vasculares) en geles de fibrina.[4]

En el modelo GTL-16, el PF-2341066 revela la capacidad de causar una marcada regresión de grandes tumores establecidos (>600 mm3) tanto en las cohortes de tratamiento de 50 mg/kg/día como de 75 mg/kg/día, con una disminución del 60 % en el volumen tumoral medio durante el programa de administración de 43 días. En otro estudio, el PF-2341066 muestra la capacidad de inhibir completamente el crecimiento tumoral de GTL-16 durante >3 meses, con solo 1 de 12 ratones mostrando un aumento significativo en el crecimiento tumoral durante el programa de tratamiento de 3 meses a 50 mg/kg/día. En el modelo de CPNM NCI-H441, se observa una disminución del 43 % en el volumen tumoral medio a 50 mg/kg/día durante el ciclo de administración de PF-2341066 de 38 días. En el modelo de CCR Caki-1, se observa una disminución del 53 % en el volumen tumoral medio asociada a una disminución del volumen de cada tumor en al menos un 30 % a 50 mg/kg/día durante el ciclo de administración de PF-2341066 de 33 días. El PF-2341066 también revela una prevención casi completa del crecimiento de tumores establecidos a 50 mg/kg/día en los modelos de xenoinjertos de glioblastoma U87MG o carcinoma prostático PC-3, con un 97 % o 84 % de inhibición en el último día del estudio, respectivamente. En contraste, el PF-2341066 administrado por vía oral a 50 mg/kg/día no inhibe significativamente el crecimiento tumoral en el modelo de carcinoma de mama MDA-MB-231, o el modelo de carcinoma de colon DLD-1. Se observa una reducción significativa dosis-dependiente de las células endoteliales CD31-positivas a 12,5 mg/kg/día, 25 mg/kg/día y 50 mg/kg/día en tumores GTL-16, lo que indica que la inhibición de la MVD muestra una correlación dosis-dependiente con la eficacia antitumoral. El PF-2341066 muestra una reducción significativa dosis-dependiente de los niveles plasmáticos humanos de VEGFA e IL-8 en los modelos GTL-16 y U87MG. Se observa una marcada inhibición de los niveles fosforilados de c-Met, Akt, Erk, PLCλ1 y STAT5 en tumores GTL-16 después de la administración oral de PF-2341066.[4]

• Ensayos ELISA de fosforilación de quinasas celulares

  Las células se siembran en placas de 96 pocillos en medios suplementados con 10 % de suero bovino fetal (FBS) y se transfieren a medios sin suero [con 0,04 % de albúmina de suero bovino (BSA)] después de 24 h. En experimentos que investigan la fosforilación de RTK dependiente de ligando, se añaden los factores de crecimiento correspondientes durante un máximo de 20 min. Después de la incubación de las células con PF-2341066 durante 1 h y/o ligandos apropiados durante los tiempos designados, las células se lavan una vez con HBSS suplementado con 1 mM de Na₃VO₄, y se generan lisados de proteínas a partir de las células. Posteriormente, la fosforilación de Protein Tyrosine Kinase seleccionadas se evalúa mediante un método ELISA tipo sándwich utilizando anticuerpos de captura específicos utilizados para recubrir placas de 96 pocillos y un anticuerpo de detección específico para residuos de tirosina fosforilados. Las placas recubiertas con anticuerpos se (a) incuban en presencia de lisados de proteínas a 4 °C durante la noche; (b) se lavan siete veces en 1 % de Tween 20 en PBS; (c) se incuban en un anticuerpo anti-fosfotirosina total (PY-20) conjugado con peroxidasa de rábano picante (1:500) durante 30 min; (d) se lavan siete veces de nuevo; (e) se incuban en sustrato de peroxidasa de 3,3′,5,5′-tetrametilbencidina para iniciar una reacción colorimétrica que se detiene añadiendo 0,09 N H₂SO₄; y (f) se mide la absorbancia a 450 nm utilizando un espectrofotómetro.

• Líneas celulares

  GTL-16 gastric carcinoma cells and T47D breast carcinoma cells

• Concentraciones

  0-256 nM

• Tiempo de incubación

  1 h

• Método

  Cells including GTL-16 gastric carcinoma cells and T47D breast carcinoma cells are seeded in 96-well plates in media supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and transferred to serum-free media [with 0.04% bovine serum albumin (BSA)] after 24 hours. In experiments investigating ligand-dependent RTK phosphorylation, corresponding growth factors are added for up to 20 minutes. After incubation of cells with PF-2341066 for 1 hour and/or appropriate ligands for the designated times, cells are washed once with HBSS supplemented with 1 mM Na₃VO₄, and protein lysates are generated from cells. Subsequently, phosphorylation of selected protein kinases is assessed by a sandwich ELISA method using specific capture antibodies used to coat 96-well plates and a detection antibody specific for phosphorylated tyrosine residues. Antibody-coated plates are (a) incubated in the presence of protein lysates at 4 °C overnight; (b) washed seven times in 1% Tween 20 in PBS; (c) incubated in a horseradish peroxidase–conjugated anti–total-phosphotyrosine (PY-20) antibody (1:500) for 30 min; (d) washed seven times again; (e) incubated in 3,3^′,5,5^′-tetramethyl benzidine peroxidase substrate to initiate a colorimetric reaction that is stopped by adding 0.09 N H₂SO₄; and (f) measured for absorbance in 450 nm using a spectrophotometer.

• Modelos animales

  Female or male nu/nu mice bearing NCI-H441,or DLD-1, or MDA-MB-231

• Dosificaciones

  12.5 mg/kg/day, 25 mg/kg/day, and 50 mg/kg/day

• Administración

  p.o.