CHIR-124

CHIR-124 es una pequeña molécula basada en quinolonas que no está estructuralmente relacionada con otros inhibidores conocidos de Chk1. Este compuesto interactúa sinérgicamente con venenos de topoisomerasa (por ejemplo, Camptotecina o SN-38) causando la inhibición del crecimiento en una variedad de líneas celulares cancerosas, incluyendo el carcinoma de mama (MDA-MB-231 y MDA-MB-435) y el carcinoma de colon (SW-620 y Colo205), todas las cuales contienen el gen p53 mutante. Abroga los Cell Cycle Checkpoints S y G2-M inducidos por SN-38 y potencia la apoptosis en células de cáncer de mama MDA-MD-435. La abrogación del Cell Cycle Checkpoint G2-M y la inducción de apoptosis por este químico se potencian con la pérdida de p53. [1] Este compuesto también se dirige potentemente a otras quinasas como PDGFR y Flt3 con IC50 de 6,6 nM y 5,8 nM, respectivamente. [2]

CHIR-124 potencia los efectos inhibidores del crecimiento al abolir el Cell Cycle Checkpoint G₂-M y aumentar la apoptosis tumoral en un modelo de xenoinjerto ortotópico de cáncer de mama.

• Chk1 Assay

  Para el ensayo Chk1, el dominio quinasa se expresa en células de insecto Sf9, y un péptido cdc25c biotinilado que contiene el sitio de fosforilación consenso Chk1/Chk2 (*) (biotin-[AHX]SGSGS*GLYRSPSMP-ENLNRPR[CONH2]) se utiliza como sustrato. Una serie de diluciones de CHIR-124 se mezcla con un tampón de reacción de quinasa que contiene una concentración final de 30 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 2 mM DTT, 4 mM EDTA, 25 mM β-glicerofosfato, 5 mM MnCl₂, 0,01% de albúmina sérica bovina, 1,35 nM de dominio quinasa CHK1, 0,5 μM de sustrato peptídico y 1 AM de ATP no marcado, más 5 nM de ATP marcado con ³³Pγ (actividad específica = 2.000 Ci/mmol). Las reacciones y la detección de la transferencia de fosfato se realizan mediante un método radiactivo. Las reacciones se incuban a temperatura ambiente durante 1 a 4 horas y el péptido fosforilado se captura en placas de micropocillos recubiertas de estreptavidina que contienen tampón de parada de reacción (25 mM EDTA [ácido etilendiaminotetraacético], 50 mM HEPES, pH 7,5). El péptido fosforilado se mide con el sistema DELFIA TRF utilizando un anticuerpo antifosfotirosina PT66 marcado con europio. La concentración de este compuesto para la IC50 se calcula mediante regresión no lineal con el software de análisis de datos XL-Fit.

• Líneas celulares

  MDA-MB-231, MDA-MB-435, SW-620, and COLO 205 cells

• Concentraciones

  0-2350 nM, dependent on cell types

• Tiempo de incubación

  48 hours

• Método

  MDA-MB-231, MDA-MB-435, SW-620, and COLO 205 cells in log-phase are plated into 96-well microplates. CHIR-124 is serially diluted in the presence of six different concentrations of Camptothecin or 0 nM camptothecin. Camptothecin is also serially diluted in the absence of this compound. This chemical is added to cells in 96-well dishes and incubated at 37 °C for 48 hours. Each treatment condition is done in triplicate. Cell proliferation is monitored by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5- (3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS), inner salt assay. MTS inner salt is added to the microplates, which are incubated for another 3 hours, and absorbance at 490 nm is read on a plate reader. The concentrations of each drug in the combinations required to produce 50% inhibition are plotted to generate the isoboles. Isobologram analysis of drug interaction is based the equation of Loewe additivity (1= D _A /IC50, _A + D_B/IC50, _B), where IC50, _A and IC50, _B are the concentrations of drugs to result in 50% inhibition for each drug alone, and D_A and D_B are concentrations of each drug in the combination that yield 50% overall inhibition. A diagonal line indicating Loewe additivity is included in each graph. Data points that fall below the line indicate synergy, whereas those that fall above the line will indicate antagonism

• Modelos animales

  MDA-MB-435 cells are implanted in the mammary fat pad of 8- to 10-week-old female immunodeficient mice.

• Dosificaciones

  10 mg/kg or 20 mg/kg

• Administración

  CHIR-124 is given orally four times daily × 6 on days 2 to 7 in captisol.