CFTRinh-172

CFTRinh-172 inhibe el transporte de Cl^- mediado por CFTR de forma dosis y tiempo-dependiente, y efectivamente inhibe la activación de CFTR por múltiples tipos de agonistas o activadores. [1] Este compuesto, como inhibidor selectivo del canal CFTR, también abole completamente la corriente de Cl⁻ en las células acinares y ductales de la glándula lagrimal de conejo. [2] También induce la producción de ROS, el fallo mitocondrial y la activación de la vía de señalización NF-κB, independientemente de la inhibición de CFTR. [3]

CFTRinh-172 (20 µg/6 h) abole completamente la secreción de líquido intestinal inducida por V. cholerae sin afectar el crecimiento de V. cholerae in vivo. [4]

• Procedimientos de cribado

  Los ensayos se realizan utilizando un sistema de cribado personalizado que consta de un brazo robótico de 3 metros, una incubadora de CO₂, un lavador de placas, una estación de trabajo de manipulación de líquidos, un lector de códigos de barras, una estación de desprecintado y dos lectores de placas de fluorescencia FLUOstar, cada uno equipado con dos bombas de jeringa y filtros de excitación HQ500/20X (500 ± 10 nm) y de emisión HQ535/30M (535 ± 15 nm). El sistema robótico está integrado utilizando el software SAMI versión 3.3 modificado para dos lectores de placas. Se ha escrito un software personalizado en Microsoft VBA (Visual Basic for Applications) para calcular las pendientes de fluorescencia normalizadas, sustraídas de la línea base (que proporcionan las tasas de flujo de haluros) a partir de los archivos de datos almacenados. El ensayo se configura cargando la incubadora (37 °C, 90 % de humedad, 5 % de CO₂) con 40–60 placas de 96 pocillos que contienen las células FRT, y cargando un carrusel con placas de 96 pocillos que contienen los compuestos de prueba y puntas de pipeta de plástico desechables. Para iniciar el ensayo, cada pocillo de una placa de 96 pocillos se lava tres veces en PBS (300 μl/lavado), dejando 50 μL de PBS. Se añaden diez microlitros de un cóctel activador de CFTR (5 μM de forskolina, 100 μM de IBMX, 25 μM de apigenina en PBS) y, después de 5 minutos, se añade un compuesto de prueba (0,5 μL de una solución de DMSO 1 mM) a cada pocillo para obtener una concentración final de 10 μM. Después de 10 minutos, las placas de 96 pocillos se transfieren a un lector de placas para el ensayo de fluorescencia. Cada pocillo se ensaya individualmente para el transporte de I– mediado por CFTR registrando la fluorescencia continuamente (200 ms por punto) durante 2 segundos (línea base) y luego durante 12 segundos después de la adición rápida (<0,5 segundos) de 165 μL de PBS isosmolar en el que 137 mM de Cl– fue reemplazado por I–.

• Líneas celulares

  Fischer rat thyroid (FRT) cells

• Concentraciones

  ~1 mM

• Tiempo de incubación

  24 hours

• Método

  Cell toxicity is assayed by the dihydrorhodamine method at 24 hours after cell incubation with 0–1,000 μM of this compound.

• Modelos animales

  An adult mouse model of Vibrio cholerae-induced diarrhea

• Dosificaciones

  20 µg/6 h

• Administración

  Intraperitoneal administration