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El CEP-18770 demuestra una prevención marginal de las actividades trípticas y peptidil-glutamil del Proteasome.[1] El CEP-18770 inhibe las células de cáncer de ovario A2780, el cáncer de próstata PC3, el H460, el cáncer de colon LoVo, el cáncer de mieloma múltiple RPMI8226 y el linfoma anaplásico no Hodgkin HS-Sultan con valores de IC50 de 13,7, 22,2, 34,2, 11,3, 5,6 y 8,2 nM, respectivamente.[1] El CEP-18770 bloquea la vía de ubiquitina-Proteasome en varios MM y en la línea celular de leucemia mieloide crónica, K562. El CEP-18770 provoca una acumulación de proteínas ubiquitinadas durante 4 a 8 horas.[1] La degradación de IκBα se bloquea completamente mediante el pretratamiento con CEP-18770. El CEP-18770 inhibe significativamente los altos niveles de actividad de NF-κB tanto en células RPMI-8226 como en U266. La supresión de la actividad de unión al ADN de NF-kB dependiente del tiempo y la concentración en líneas celulares de MM por CEP-18770 conduce a una disminución de la expresión de varios genes modulados por NF-κB que median el crecimiento y la supervivencia de las células tumorales, incluyendo el propio IkBα, la proteína inhibidora de la apoptosis ligada al cromosoma X (XIAP), las citocinas proinflamatorias TNF-α e interleucina-1β (IL-1β), la molécula de adhesión intracelular (ICAM1) y el factor pro-angiogénico factor de crecimiento endotelial vascular.[1] La expresión de estos genes mediados por NF-κB se asocia con una respuesta clínica más favorable a este agente, destacando su valor pronóstico potencial en respuesta a la exposición a CEP-18770.[1] La actividad proapoptótica de CEP-18770 contra el MM no se limita únicamente a las líneas celulares de MM derivadas de tumores, sino que se extiende a explantes primarios de MM de pacientes con recaída o refractarios.[1] Además, el CEP-18770 en combinación produce una inhibición sinérgica de la viabilidad de las células de MM in vitro.[2]

El CEP-18770 revela una inhibición sostenida y relacionada con la dosis del peso tumoral relativo. El CEP-18770 conduce a regresiones tumorales completas relacionadas con la dosis, lo que resulta en una incidencia del 50 % de RC a su dosis máxima tolerada (DMT) de 1,2 mg/kg por vía intravenosa.[1] El CEP-18770 revela un aumento relacionado con la dosis en la incidencia de ratones libres de tumores al finalizar estos estudios (120 días después del trasplante tumoral). La administración oral de CEP-18770 produce una marcada disminución del peso tumoral y una notable incidencia relacionada con la dosis de regresión tumoral completa con cambios mínimos en el peso corporal de los animales durante el curso de los estudios de 120 días.[1]_ELas dosis equiactivas de CEP-18770 revelan una inhibición mayor y más sostenida de la actividad del Proteasome tumoral relacionada con la dosis, correspondiendo temporalmente con la inducción máxima de la actividad de caspasa-3 y 7.[1] La señal apoptótica máxima es 2,5 veces mayor para CEP-18770. En contraste, los perfiles de inhibición del Proteasome de CEP-18870 son comparables en los tejidos periféricos normales de ratón examinados (hígado, pulmones, sangre total y cerebro [sin actividad]) tanto en su magnitud como en su duración.[1] No se detecta inhibición del Proteasome en el tejido cerebral en ningún momento para CEP-18770 o.[1] El agente único CEP-18770 PO también muestra efectos anti-MM marcados en estos modelos de xenoinjerto.[1]

• Sondeo de la actividad del Proteasome en extractos celulares

  Las células humanas de mieloma múltiple se lavan dos veces con solución salina tamponada con fosfato frío, se pelletizan y se lisan con un volumen de perlas de vidrio (<106 micras, lavadas con ácido) y un volumen igual de tampón de homogeneización (50 mM Tris (pH 7,4), 1 mM ditiotreitol, 5 mM MgCl₂, 2 mM ATP y 250 mM sacarosa) mediante vórtex a alta velocidad durante 15-30 min a 4 °C. Las perlas, las fracciones de membrana, los núcleos y los restos celulares se eliminan del sobrenadante mediante centrifugación a 16.000 g durante 5 min. El contenido proteico de los extractos se cuantifica utilizando el ensayo de Bradford. La actividad del Proteasome se ensaya como se describe a continuación. Cantidades iguales (típicamente 60 g) de proteína se desnaturalizan hirviendo en tampón de muestra reductor, se separan mediante SDS-PAGE al 12,5% y se electrotransfieren a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). La inmunotransferencia se realiza utilizando un anticuerpo policlonal dansil-sulfonamidohexanoil (1:7.500, conejo) y un anticuerpo secundario de cabra o cerdo anti-conejo acoplado a peroxidasa de rábano picante, seguido de quimioluminiscencia mejorada.

• Líneas celulares

  HMEC and TEC cells

• Concentraciones

  0-100 nM

• Tiempo de incubación

  6 hours

• Método

  HMEC and TEC cells are seeded into 24-well plates at a density of 10⁴ cells/well in DMEM supplemented with 5% FCS. After incubation with proteasome inhibitors (48 hours), cells are washed, air dried, and stained with crystal violet as described. Cell number is determined, in duplicate samples, on the basis of a standard curve obtained with known cell numbers. All experiments are performed in triplicate. In vitro formation of capillary-like structures is studied on cells (4 × 10⁴ cells/well in DMEM supplemented with 5% FCS. After incubation with proteasome inhibitors (48 hours), cells are washed (cells/well in 24-well plates) and seeded onto Matrigel-coated wells in DMEM containing 0.25% BSA. HMEC and TEC cells (5 × 10³ per well), suspended in 200 μL DMEM with 5% FCS (positive control), serum-free medium (negative control), are layered onto the Matrigel surface in the presence or absence of proteasome inhibitor CEP-18770. Cells are observed with a microscope and experimental results are then recorded after a 6-hour incubation at 37 °C. Data is analyzed, as the mean (× 1 SD) of total length of capillary-like structures, by the Micro-Image system and is expressed as mm/field by the computer analysis system in 5 different fields at 100 × magnification in duplicated wells for 4 different experiments.

• Modelos animales

  Human MM RPMI 8226 subcutaneous xenograft model in SCID mice

• Dosificaciones

  From 1.5 to 4 mg/kg, twice for 7 days to 4 weeks.

• Administración

  Intravenously