PR-171 (Carfilzomib)

El Carfilzomib (PR-171) inhibe la proliferación en una variedad de líneas celulares y células neoplásicas derivadas de pacientes, incluido el mieloma múltiple, e indujo vías de señalización apoptótica intrínsecas y extrínsecas y la activación de la cinasa c-Jun-N-terminal (JNK). Revela una actividad anti-MM mejorada, supera la resistencia a otros agentes y actúa sinérgicamente con (Dex). Este compuesto muestra una potencia inhibidora in vitro preferencial contra la actividad ChT-L en la subunidad β5, con más del 80% de inhibición a dosis de 10 nM. La exposición corta a Carfilzomib en dosis bajas conduce a una especificidad de unión preferencial para el β5 Proteasome constitutivo 20S y las subunidades del inmunoproteasoma β5i. La medición de la actividad de la caspasa en células ANBL-6 pulsadas con él revela aumentos sustanciales en la actividad de la caspasa-8, caspasa-9 y caspasa-3 después de 8 horas, lo que da un aumento de 3.2, 3.9 y 6.9 veces, respectivamente, sobre las células control después de 8 horas. En las células tratadas con Carfilzomib pulsado, la integridad de la membrana mitocondrial disminuye al 41% (Q1 + Q2), en comparación con el 75% en las células control tratadas con vehículo. [1] En otro estudio, también ha demostrado eficacia preclínica contra malignidades hematológicas y sólidas. [2] Inhibe directamente la formación de osteoclastos y la resorción ósea. [3]

Carfilzomib (PR-171) reduce moderadamente el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto in vivo. Disminuye eficazmente la viabilidad de las células de mieloma múltiple después de un tratamiento continuo o transitorio. Este compuesto también aumenta el volumen óseo trabecular, disminuye la resorción ósea y mejora la formación ósea en ratones sin tumor. [3]

• Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas para el perfil de subunidades de carfilzomib

  Las células ANBL-6 (2 × 10⁶/pozo) se siembran en placas de 96 pozos y se tratan con Carfilzomib (PR-171) a dosis de 0,001 a 10 μM durante 1 hora. Luego se lisan las células (20 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA) y los lisados clarificados se transfieren a placas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se genera una curva estándar utilizando lisados de células ANBL-6 no tratadas, comenzando con una concentración de 6 μg de proteína/μL. Se añade la sonda del sitio activo [biotina-(CH2)4-Leu-Leu-Leu-epoxicetona; 20 μM] y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego, los lisados celulares se desnaturalizan añadiendo un 1% de dodecil sulfato de sodio (SDS) y calentando a 100°C, seguido de la mezcla con 20 μL por pozo de perlas de estreptavidina-sefarosa de alto rendimiento en una placa multiscreen DV de 96 pozos y se incuban durante 1 hora. Estas perlas se lavan luego con tampón de ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) (PBS, 1% de albúmina de suero bovino y 0,1% de Tween-20) y se incuban durante la noche a 4°C en un agitador de placas con anticuerpos para las subunidades del Proteasome. Los anticuerpos utilizados incluyeron monoclonales de ratón anti-β1, anti-β2, anti-β1i y anti-β5i, policlonales de cabra anti-β2i y policlonales de conejo anti-β5 (antisueros purificados por afinidad contra el péptido KLH-CWIRVSSDNVADLHDKYS). Las perlas se lavan y se incuban durante 2 horas con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante de cabra anti-conejo, cabra anti-ratón o conejo anti-cabra. Después del lavado, las perlas se desarrollan utilizando el sustrato de picochemiluminiscencia Supersignal ELISA. Se realiza la detección luminiscente. La luminiscencia bruta se convierte a μg/mL mediante comparación con la curva estándar y se expresa como el % de inhibición relativa al control del vehículo. Los ajustes de curva se generan utilizando la siguiente ecuación de dosis-respuesta no sigmoidal: Y = Fondo + (Superior-Fondo)/(1 + 10̂((LogEC50 − X) × Pendiente)), donde X es el logaritmo de la concentración, Y es el % de inhibición y EC50 es la dosis de este compuesto que muestra un efecto del 50 %.

• Líneas celulares

  WST-1, ANBL-6 cells

• Concentraciones

  100 nM

• Tiempo de incubación

  1 hour

• Método

  WST-1 is used to determine the effects of Carfilzomib (PR-171), a proteasome inhibitor, on cell proliferation. The inhibition of proliferation is calculated in relation to parallel control cells that receives vehicle alone. A linear spline function is used to interpolate the median inhibitory concentration (IC50) using XLfit 4 software. The degree of resistance (DOR) is calculated using the formula: DOR = IC50(resistant cells)/IC50(sensitive cells). ANBL-6 cells pulsed with 100 nM of this compound are washed and suspended in PBS containing 5 μg/mL of JC-1, which exhibits potential-dependent accumulation in mitochondria. Analysis of the mitochondrial membrane potential-dependent color shift from 525 to 590 nm is carried out on a FacScan, and the data are analyzed with CellQuest software.

• Modelos animales

  Beige-nude-XID mice

• Dosificaciones

  2.0 mg/kg

• Administración

  i.v.