BX-795

BX-795 bloquea eficazmente la actividad de PDK1 en células PC-3, como lo demuestra su capacidad para bloquear la fosforilación de S6K1, Akt, PKCδ y GSK3β. Este compuesto inhibe potentemente el crecimiento de células tumorales en plástico con un IC50 de 1,6, 1,4 y 1,9 μM para las células MDA-468, HCT-116 y MiaPaca, respectivamente. En agar blando, muestra una mayor inhibición del crecimiento con un IC50 de 0,72 y 0,25 μM para las células MDA-468 y PC-3, respectivamente. [1]

Además, este químico, como inhibidor de TBK1/IKKɛ, bloquea la activación de IRF3 mediada por TBK1 e IKKε y la producción de IFN-β. [2]

En las respuestas fisiológicas de las plaquetas, este compuesto produce un efecto inhibidor sobre la agregación inducida por 2-MeSADP o colágeno, la secreción de ATP y la generación de tromboxano. [3]

BX-795, un inhibidor de TBK-1 y PDK-1, también inhibe la traducción de proteínas del HSV.

• Ensayos de quinasas

  PDK1 se ensaya en un ensayo de quinasa directo y en un formato de ensayo acoplado que mide la activación de AKT2 mediada por PDK1 y PtdIns-3,4-P2. Para el ensayo acoplado, la mezcla de ensayo final (60 μL) contenía: 15 mM MOPS, pH 7.2, 1 mg/mL de albúmina sérica bovina, 18 mM de β-glicerol fosfato, 0.7 mM de ditiotreitol, 3 mM de EGTA, 10 mM de MgOAc, 7.5 μM de ATP, 0.2 μCi de [γ-³³P]ATP, 7.5 μM de péptido sustrato biotinilado (biotin-ARRRDGGGAQPFRPRAATF), 0.5 μL de vesículas fosfolipídicas que contienen PtdIns-3,4-P2, 60 pg de PDK1 humano recombinante purificado y 172 ng de AKT2 humano recombinante purificado. Después de la incubación durante 2 h a temperatura ambiente, el péptido marcado con biotina se captura a partir de 10 μl de la mezcla de ensayo en perlas SPA recubiertas con estreptavidina, y la formación del producto se mide por proximidad de centelleo en un contador Wallac MicroBeta. El producto formado es proporcional al tiempo de incubación y a la cantidad de PDK1 y AKT2 inactiva añadidos. Este compuesto se añade en niveles subóptimos para que el ensayo pueda detectar sensiblemente los inhibidores de la activación de AKT2, así como los inhibidores directos de PDK1 o AKT2. Para medir directamente la actividad de PDK1, la mezcla de ensayo final (60 μL) contenía 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1 mM EGTA, 0.1 mM EDTA, 0.1% de β-mercaptoetanol, 1 mg/mL de albúmina sérica bovina, 10 mM de MgOAc, 10 μM de ATP, 0.2 μCi de [γ-³³P]ATP, 7.5 μM de péptido sustrato (H2N-ARRRGVTTKTFCGT) y 60 ng de PDK1 humano recombinante purificado. Después de 4 h a temperatura ambiente, añadimos 25 mM de EDTA y aplicamos una porción de la mezcla de reacción en papel de fosfocelulosa Whatman P81. El papel de filtro se lava tres veces con ácido fosfórico al 0.75% y una vez con acetona. Después del secado, el péptido marcado unido al filtro se cuantifica usando un fosfoimager Fuji.

• Líneas celulares

  MDA-468, PC-3, HCT-116 and MiaPaca cells

• Concentraciones

  ~10 μM

• Tiempo de incubación

  72 hours

• Método

  Cells seeded at a low density (1,500–3,000 cells/well, 0.1 mL/well, 96-well plates) are incubated overnight. Compound treatments are made by adding 10 μL/well of this compound in 1% dimethyl sulfoxide and growth medium (final concentration of dimethyl sulfoxide, 0.1%), followed by brief shaking. Treated cells are incubated for 72 hours, and viability is measured by the addition of 10 μL of the metabolic dye WST-1. The WST-1 signal is read in a plate reader at 450 nm, and a no cell, or zero time cell, background is subtracted to calculate the net signal. Results are reported as the average ± S.E. of two or more replicates.