BIO-acetoxime

Las actividades de las quinasas se analizan en Tampón A o C, a 30 °C, a una concentración final de ATP de 15 μM. Se restan los valores en blanco y las actividades se calculan como pmoles de fosfato incorporado durante una incubación de 10 min. Las actividades se expresan en % de la actividad máxima, es decir, en ausencia de inhibidores. Los controles se realizan con diluciones apropiadas de DMSO. GSK-3α/β se purifica de cerebro porcino mediante cromatografía de afinidad en axina inmovilizada. Se ensaya, después de una dilución 1/100 en 1 mg de BSA/mL 10 mM DTT, con 5 μL de 40 μM de péptido GS-1 como sustrato, en tampón A, en presencia de 15 μM de [γ-³³P] ATP (3000 Ci/mmol; 1 mCi/mL) en un volumen final de 30 μL. Después de 30 min de incubación a 30 °C, se aplican alícuotas de 25 μL del sobrenadante sobre trozos de papel de fosfocelulosa Whatman P81 de 2,5 × 3 cm y, 20 s después, los filtros se lavan cinco veces (durante al menos 5 min cada vez) en una solución de 10 mL de ácido fosfórico/litro de agua. Los filtros húmedos se cuentan en presencia de 1 mL de líquido de centelleo ACS. CDK1/ciclina B se extrae en tampón de homogeneización de ovocitos de estrella de mar (Marthasterias glacialis) en fase M y se purifica mediante cromatografía de afinidad en perlas de sefarosa p9CKShs1, de las cuales se eluye por p9CKShs1 libre. La actividad quinasa se ensaya en tampón C, con 1 mg de histona H1 /mL, en presencia de 15 μM de [γ-³²P] ATP (3000 Ci/mmol; 1 mCi/mL) en un volumen final de 30 μL. Después de 10 min de incubación a 30 °C, se aplican alícuotas de 25 μL del sobrenadante sobre papeles de fosfocelulosa P81 y se tratan como se describe anteriormente. CDK5/p25 se reconstituye mezclando cantidades iguales de CDK5 y p25 de mamífero recombinantes expresados en E. coli como proteínas de fusión GST (glutatión-S-transferasa) y purificados mediante cromatografía de afinidad en glutatión-agarosa (p25 es una versión truncada de p35, el activador de CDK5 de 35 kDa). Su actividad se ensaya en tampón C como se describe para CDK1/ciclina B.0

KCN, KCNR, SY5Y, Kelly, and IMR32 cells

~1 μM

72 h

Cell viability is analyzed by CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay according to manufacturer's instructions, approximately 5,000 cells are plated per well of 96-well tissue culture plates with 100 μL of medium. To assess cell viability, rather than proliferation rate, inhibitor- and control-treated cells are assayed after the same growth time had elapsed. The results represent the mean ± SD of triplicate samples, expressed as a percentage of control.