Bafilomycin A1 (Baf-A1)

El medio del ensayo enzimático de ATPasa contiene 6 mM de MgSO₄, 50 mM de HEPES (pH 7.4), 200 mM de Na₂SO₃ (activador de V-ATPase), 0.5 mM de orto-vanadato de sodio (inhibidor de P-ATPase), 0.5 mM de azida de sodio (inhibidor de F-ATPase) y 3 mM de Na₂ATP. Este medio (1.0 mL), con o sin la adición del inhibidor de ATPasa tipo V Bafilomycin A1 (Baf-A1), se incuba con el homogeneizado filtrado (0.1 mL) durante 60 minutos a 23–25 °C. La reacción se detiene con la adición de 1 mL de TCA al 3%. Los blancos espectrométricos se preparan como para el ensayo enzimático, con la excepción de que la muestra de tejido se añade después del ácido. El análisis de fosfato se realiza añadiendo 2 mL de 1-butanol y 0.2 mL de solución de molibdato (5 g de molibdato de amonio, 22 mL de H₂SO₄ hasta 100 mL). Después de vortexear durante 15 segundos, la solución se neutraliza con 0.5 mL de solución de citrato (100 g/500 mL, pH 7.0) y se vuelve a vortexear durante 15 segundos. Luego, la solución se centrifuga (2000 × g; 3 minutos) para separar la fase de butanol y la absorbancia de esta fase se lee a 400 nm. Se preparan estándares de ortofosfato (0.1 μM–2.0 μM) y se tratan de la misma manera que los ensayos de actividad enzimática. La actividad enzimática se expresa en μmol de ortofosfato liberado por hora y por miligramo de proteína. La actividad de V-ATPase se considera la diferencia entre la actividad ATPasa total medida en presencia de Na₂SO₃, ortovanadato de sodio y azida de sodio y la actividad ATPasa medida en presencia de estos reactivos y de este compuesto.

HeLa cells

~20 nM

20 hours

H. pylori bacteria extract is treated with inhibitors, before addition to HeLa cells, as follows: DCCD 10 mM for 1 hour at 30 ºC; NBD-CI 100 μM for 1 hour at 30 ºC and the reaction is blocked with glycine 10 mM final concentration; NEM 275 μM for 1 hour at 30 ºC and the reaction is blocked by addition of β-mercaptoethanol 275 mM; Mg-ATP 14 μM for 1 hour at 0 ºC; 100 μM KNO₃ and 14 μM Mg-ATP for 1 hour at 30 μM; NaCO₃ 100 μM, pH 11 for 1 hour at 0 ºC. The bacterial extract is then added to cell with a 40-fold dilution at a final concentration of 0.65 mg/mL. Controls are HeLa cells incubated with untreated bacterial extracts and cells treated with Bafilomycin A1 (Baf-A1) under the same conditions as bacterial extracts, at the same concentrations or after a 40-fold dilution. The vacuotating activity of the bacterial extracts is assayed.

Young (approximately 9 days old) Mozambique tilapia, Oreochromis mossambicus

10 μM

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