Tivantinib

Se ha demostrado que ARQ-197 previene las respuestas celulares inducidas por HGF/c-met in vitro. Este compuesto posee actividad antitumoral; inhibiendo la proliferación de células A549, DBTRG y NCI-H441 con una IC50 de 0,38, 0,45, 0,29 μM. El tratamiento con este agente resulta en una disminución de la fosforilación de la cascada de señalización MAPK y la prevención de la invasión y migración. Además, la expresión ectópica de c-Met en NCI-H661, una línea celular sin expresión endógena de c-Met, hace que adquiera un fenotipo invasivo que también es suprimido por este químico. Aunque la adición de concentraciones crecientes de este inhibidor no afecta significativamente el K_m de ATP, la exposición de c-Met a 0,5 μM de esta sustancia disminuyó la V_max de c-Met en aproximadamente 3 veces. La capacidad de esta molécula para disminuir la V_max sin afectar el Km de ATP confirmó que inhibe c-Met a través de un mecanismo no-ATP-competitivo y, por lo tanto, puede explicar su alto grado de selectividad de quinasa. Previene el c-Met recombinante humano con una constante inhibidora calculada K_i de aproximadamente 355 nM. Aunque la concentración más alta de ATP utilizada es de 200 μM, la potencia de este compuesto contra c-Met no se reduce al usar concentraciones de ATP de hasta 1 mM. Bloquea la fosforilación de c-Met y las vías de señalización de c-Met aguas abajo. Este químico suprime la autofosforilación constitutiva y mediada por ligando de c-Met y, por extensión, la actividad de c-Met, lo que a su vez conduce a la inhibición de los efectores de c-Met aguas abajo. Su inducción de apoptosis dependiente de caspasas se incrementa en células cancerosas humanas que expresan c-Met, incluidas las células HT29, MKN-45 y MDA-MB-231.[1][2]

Los tres modelos de xenoinjertos tratados con Tivantinib muestran reducciones en el crecimiento tumoral: 66% en el modelo HT29, 45% en el modelo MKN-45 y 79% en el modelo MDA-MB-231. En estos estudios de xenoinjertos, no se observaron cambios significativos en el peso corporal después de la administración oral de este compuesto a 200 mg/kg. Farmacodinámicamente, la fosforilación de c-Met en tumores de xenoinjertos de colon humano (HT29) se inhibe fuertemente por este químico, según se evaluó por una reducción dramática de la autofosforilación de c-Met 24 horas después de una dosis oral única de 200 mg/kg de este agente. Esta misma dosis en ratones exhibe que los xenoinjertos tumorales están expuestos a niveles plasmáticos sostenidos del compuesto, consistente con la inhibición farmacodinámica observada de la fosforilación de c-Met y la inhibición de la proliferación de líneas celulares cancerosas que albergan c-Met. Los niveles plasmáticos del agente 10 horas después de la dosificación se determinaron en 1,3 μM, más de 3 veces por encima de la constante inhibidora bioquímica de esta sustancia para c-Met. Por lo tanto, es capaz de suprimir su objetivo in vivo en el tejido tumoral humano xenoinjertado. En conclusión, este inhibidor bloquea el crecimiento de tumores humanos xenoinjertados dependientes de c-Met.[1]

• Ensayo de quinasa in vitro SDS-PAGE de c-Met

  La proteína c-Met recombinante (100 ng) se preincuba con concentraciones crecientes de este compuesto durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la preincubación, se añaden 100 μM de sustrato poli-Glu-Tyr y varias concentraciones de ATP que contienen 5 μCi de [γ-32P]ATP a la mezcla de reacción. La reacción se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente y luego se detiene con la adición de 5 μL de gel de SDS-poliacrilamida, tampón de muestra reductor. Las muestras se cargan luego en un gel de acrilamida al 7,5% y se realiza una SDS-PAGE. Los sustratos poli-Glu-Tyr fosforilados se visualizan finalmente mediante autorradiografía. La actividad de c-Met se cuantifica por densitometría.

• Líneas celulares

  T29, MKN-45 and MDA-MB-231 cells

• Concentraciones

  0.03-10 μM

• Tiempo de incubación

  24, 32, and 48 hours

• Método

  HT29, MKN-45, and MDA-MB-231 cells are seeded in black 96-well plates at 5 × 10³ cells per well overnight in a medium with 10% FBS. The next day, cells are treated with increasing concentrations of this compound (0.03-10 μM) for 24, 32, and 48 hours at 37 °C. After this compound treatment, the drug-containing medium is removed and cells are incubated for at least 10 minutes in a labeling solution (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, and 6 mM CaCl₂) containing 2 μg/mL Hoescht 33342 (blue channel), 500-times diluted Annexin V-FITC (green channel), and 1 μg/mL propidium iodide (red channel). High-content image acquisition and analysis are carried out. The program is set to take four images per well. The exposure time is set at 16.7 ms/10% gain, 500 ms/35% gain, and 300 ms/30% gain for the 4,6-diamidino-2-phenylindole, FITC, and rhodamine channels, respectively. Images are processed and the numbers of positive cells for each channel and each condition are determined. In addition, HT29 cells are treated with increasing concentrations of this compound for 32 hours in the absence or the presence of 25, 50, and 100 μM ZvAD-FMK (irreversible general caspase inhibitor), and the same procedures are undertaken. All experiments are done in triplicate. To determine whether the apoptotic effect is due to c-Met inhibition, the effect of this compound when glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and c-Met are knocked down using siRNA is investigated. HT29, MKN-45, and MDA-MB-231 cells are transfected with a nontargeted control siRNA, a gapgh-targeted control siRNA, or a met-targeted siRNA. After 3 days, c-Met, GAPDH, and β-actin expression levels are determined using specific antibodies. To determine if the effect is caspase dependent, HT29, MKN-45, and MDA-MB-231 cells are transfected with a met-targeted siRNA for 2 days and incubated in the absence or the presence of increasing concentrations of ZvAD-FMK for 1 additional day. A nontargeted siRNA and a gapgh-targeted siRNA (siRNA GAPDH) are also transfected in parallel, as controls. Cells are then stained with Annexin V-FITC and propidium iodide, and the percentage of apoptotic cells is determined.

• Modelos animales

  Female athymic nude mice bearing HT29, MKN-45, or MDA-MB-231 tumor xenografts

• Dosificaciones

  200 mg/kg

• Administración

  Orally administered