SB203580 (Adezmapimod)

Adezmapimod (SB203580) inhibe la proliferación de células T humanas primarias, células T murinas CT6 o células B BAF F7 inducida por IL-2 con una IC50 de 3-5 μm. También inhibe la activación de p70S6 quinasa inducida por IL-2, aunque la concentración requerida es ligeramente superior con una IC50 superior a 10 μm. Este compuesto inhibe la actividad de PDK1 de forma dosis-dependiente con una IC50 en el rango de 3-10 μm. [1] Inhibe la estimulación de MAPKAPK2 por p38-MAPK con una IC50 de aproximadamente 0,07 μM, mientras que la actividad total de SAPK/JNK se inhibe con una IC50 de 3-10 μM. A concentraciones más altas, activa la vía ERK, lo que posteriormente mejora la actividad transcripcional de NF-κB. [2] También induce autofagia en células de carcinoma hepatocelular (CHC) humano. [3]

Adezmapimod (SB203580) protege el miocardio porcino contra la lesión isquémica en un modelo in vivo. [4]También es eficaz en la prevención y el tratamiento de la enfermedad en el modelo de ratones MRL/lpr de lupus eritematoso sistémico (LES). [5]

• Ensayo de fosforilación de quinasa de receptores celulares

  4 μg de anti-PKBα de oveja se inmovilizan en 25 μL de proteína G-Sepharose durante la noche (o 1,5 horas) y se lavan en tampón A (50 mm Tris, pH 7,5, 1 mm EDTA, 1 mm EGTA, 0,5 mm Na₃VO₄, 0,1 % β-mercaptoetanol, 1 % Triton X-100, 50 mm fluoruro de sodio, 5 mm pirofosfato de sodio, 0,1 mm fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 μg/mL de pepstatina, leupeptina y 1 μm de microcistina). El anti-PKB inmovilizado se incuba luego con 0,5 mL de lisado (de 5 × 10⁶ células) durante 1,5 horas y se lava tres veces en 0,5 mL de tampón A suplementado con 0,5 m NaCl, dos veces en 0,5 mL de tampón B (50 mm Tris-HCl, pH 7,5, 0,03 % (p/v) Brij-35, 0,1 mm EGTA y 0,1 % β-mercaptoetanol), y dos veces con 100 μL de tampón de dilución para ensayo; el tampón de dilución 5× para ensayo es 100 mm MOPS, pH 7,2, 125 mm β-glicerofosfato, 25 mm EGTA, 5 mm ortovanadato de sodio, 5 mm DTT. Al complejo inmune de la enzima PKB se añaden 10 μL de tampón de dilución para ensayo, 40 μm de péptido inhibidor de proteína quinasa A, 100 μm de péptido sustrato específico de PKB y 10 μCi de [γ-³²P]ATP, todos preparados en tampón de dilución para ensayo. La reacción se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente con agitación, luego las muestras se centrifugan brevemente y se retiran 40 μL del volumen de reacción a otro tubo al que se añaden 20 μL de ácido tricloroacético al 40 % para detener la reacción. Esto se mezcla y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente, y 40 μL se transfieren a papel de fosfocelulosa P81 y se dejan unir durante 30 segundos. La pieza de P81 se lava tres veces en ácido fosfórico al 0,75 % y luego en acetona a temperatura ambiente. La incorporación de γ-³²P se mide luego mediante recuento por centelleo.

• Líneas celulares

  CT6 cell , BA/F3 F7 cell

• Concentraciones

  0–30 μM

• Tiempo de incubación

  1 hour

• Método

  CT6 cell and BA/F3 F7 cell are rested by washing three times in RPMI and culturing overnight in RPMI, 5% fetal calf serum in the absence of growth factor, antibiotics, or β-mercaptoethanol supplements. 2–5 × 10⁶ rested CT6 cells are resuspended in 2 mL of RPMI, 5% fetal calf serum and preincubated with Adezmapimod (SB203580) or vehicle control as indicated in figure legends. Cells are then stimulated with 20 ng/ml recombinant human IL-2 for 5 minutes at 37  °C and pelleted in a minifuge for 30 seconds, medium is aspirated, and the pellet is lysed in the appropriate buffer. BA/F3 cells stably expressing deletion mutants of IL-2 receptor β chain are maintained in glutamine containing RPMI further supplemented with 5% fetal calf serum and 0.2 μg/mL G418. The cells are then washed extensively, rested overnight, and washed again before activating with IL-2; such cell preparations are >90% T cells. Cellular proliferation assays are performed by measurement of [³H]thymidine incorporation.

• Modelos animales

  Systemic lupus erythematosus (SLE) are established in female MRL/lpr mice and female C57BL/6 mice

• Dosificaciones

  0.1 M/day

• Administración

  Orally administered