Opaganib (ABC294640)

Los valores de IC50 para Opaganib (ABC294640) y DMS se determinan mediante un ensayo de actividad de SK basado en HPLC recientemente desarrollado. En resumen, los compuestos de prueba se incuban con SK1 o SK2 recombinantes y NBD-Sph en los tampones de ensayo selectivos de isozimas detallados a continuación con 1 mg/ml de albúmina sérica bovina libre de ácidos grasos, 100 μM de ATP y 400 μM de MgCl₂. El producto, es decir, NBD-S1P, se separa de NBD-Sph por HPLC de la siguiente manera: sistema HPLC Waters 2795 con un detector de fluorescencia Waters 2495, columna C8 Chromolith RP-8e (100 × 4.6 mm), fase móvil de 1 ml/min (acetonitrilo/tampón de fosfato de sodio 20 mM, pH 2.5, a 45:55). La fluorescencia se monitoriza con excitación a 465 nm y emisión a 531 nm. La relación de NBD-S1P/(NBD-Sph + NBD-S1P) se utiliza como medida de la actividad de SK. Los tampones de ensayo selectivos de isozimas de SK contenían cada uno 20 mM Tris, pH 7.4, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 3 mM β-mercaptoetanol, 5% glicerol, 1× inhibidores de proteasa y 1× inhibidores de fosfatasa. Para el tampón de ensayo SK1, se añade 0.25% (final) de Triton X-100; y para el tampón SK2, se añade 1 M (final) de KCl. Los ensayos se realizan durante 2 h a temperatura ambiente, y luego se añade 1.5 volúmenes de metanol para terminar la reacción de la quinasa. Después de 10 min, las muestras se centrifugan a 20,000 g para precipitar la proteína, y los sobrenadantes se analizan por HPLC. En experimentos para determinar el Ki para la inhibición de SK2 por este compuesto, se utiliza el sistema de ensayo ADP Quest para medir la actividad de la quinasa en presencia de concentraciones variables de esfingosina y del compuesto. Para determinar los efectos de Opaganib en la actividad celular de SK, las células MDA-MB-231 casi confluentes se someten a privación de suero durante la noche, y luego se tratan con concentraciones variables del compuesto. Las células se incuban luego con [³H]esfingosina a una concentración final de 1 μM. Las células captan la esfingosina exógena, que se convierte en S1P a través de la actividad de SK, y [³H]S1P se separa de [³H]esfingosina mediante extracción y se cuantifica mediante recuento por centelleo.

1025LU, Hep-G2, A-498, MCF-7, Caco-2, MDA-MB-231, HT-29, Panc-1, DU145, T24, and SK-OV-3 cell lines

~50 μM

72 h

To determine the effects of the test compounds on proliferation, cells are plated into 96-well microtiter plates and allowed to attach for 24 h. Varying concentrations of Opaganib (ABC294640) are added to individual wells and the cells are incubated for an additional 72 h. At the end of this period, the number of viable cells is determined by use of the sulforhodamine-binding assay. The percentage of cells killed is calculated as the percentage decrease in sulforhodamine-binding compared with control cultures. Regression analyses of inhibition curves are performed by use of GraphPad Prism.

Female BALB/c mice bearing JC tumors

~100 mg/kg

p.o.