A-769662

A-769662 estimula la AMPK de hígado de rata parcialmente purificada con un EC50 de 0,8 μM. Este compuesto activa la AMPK purificada de múltiples tejidos y especies de manera dosis-respuesta con modestas variaciones en los EC50 observados. Los EC50 determinados para este químico usando extractos de AMPK parcialmente purificados de corazón de rata, músculo de rata o células renales embrionarias humanas (HEKs) son 2,2 mM, 1,9 mM o 1,1 mM, respectivamente. Un tratamiento de 4 horas de hepatocitos primarios de rata con este compuesto aumenta la fosforilación de ACC de forma dosis-dependiente, lo que se correlacionó con la inhibición de la síntesis de ácidos grasos con un IC50 de 3,2 μM. También inhibe la síntesis de ácidos grasos en hepatocitos de ratón con un IC50 de 3,6 μM [1] Este compuesto activa la AMPK tanto alostéricamente como inhibiendo la desfosforilación de AMPK en Thr-172, similar a los efectos de AMP. [2] Inhibe la función proteasómica mediante un mecanismo independiente de AMPK. Este químico afecta la actividad in vitro de proteasomas 26S purificados pero no la actividad in vitro de proteasomas 20S purificados. Tiene efectos tóxicos en células MEF. [3] Una investigación reciente muestra que este compuesto inhibió la proliferación celular y la síntesis de ADN. [4]

El tratamiento a corto plazo de ratas Sprague Dawley normales con A-769662 disminuye los niveles de malonil CoA hepático y la relación de intercambio respiratorio, VCO2/VO2, lo que indica un aumento de la tasa de oxidación de ácidos grasos en todo el cuerpo. El tratamiento de ratones ob/ob con 30 mg/kg b.i.d. de este compuesto disminuye la expresión hepática de PEPCK, G6Pase y FAS, reduce la glucosa plasmática en un 40%, disminuye el aumento de peso corporal y reduce significativamente los niveles de triglicéridos tanto plasmáticos como hepáticos. [1]

• Ensayo de AMPK de 96 pocillos

  La actividad de AMPK se mide monitorizando la fosforilación del sustrato peptídico SAMS (20 μM en ensayos estándar y 100 μM en ensayos de aditividad) siguiendo un protocolo previamente descrito (Anderson et al., 2004). Para determinar si la activación de AMPK inducida por A-769662 ocurre de manera reversible, se preincuban AMP o este compuesto con AMPK de hígado de rata durante 10 minutos a 20 veces las concentraciones de ensayo estándar antes de la dilución y la medición de la actividad de AMPK.

  [1]

• Líneas celulares

  MEF cells

• Concentraciones

  300 μM

• Tiempo de incubación

  24 hours

• Método

  Cell viability of MEF cells treated or not with A-769662 is performed as follows: cells are harvested by trypsinization and incubated with 0.5 mg/mL RNase and 50 μg/mL propidium iodine at room temperature in the dark; cell viability is analyzed by flow cytometry using a FACScanto flow cytometer, using an excitation laser at 488 nm and a propidium iodine fluorescence detection at 600 nm. To determine the proportion of cells in each phase of the cell cycle, cells are harvested by trypsinization, collected by centrifugation, washed in PBS and fixed overnight in 80% ethanol at -20 °C. Subsequently, these fixed cells are centrifuged to remove the fixative and incubated for 20 minutes in the dark at room temperature in PBS containing 0.5 mg/mL RNase and 50 μg/mL propidium iodine. Flow cytometry analysis is performed as above. The proportion of cells in G1, S, and G2 is determined using the MODFIT program. Cell culture pictures are taken at the indicated times using a camera coupled to an inverted microscope with a 20 × objective.

• Modelos animales

  Sprague Dawley rats

• Dosificaciones

  30 mg/kg

• Administración

  Administered via i.p.