ZSTK474

ZSTK474 a 1 μM reduce potentemente la actividad de PI3K al 4,7% del nivel de control, mientras que LY2194002 solo reduce la actividad al 44,6% del control. Este compuesto inhibe las actividades de las p110β, -γ y -δ recombinantes con IC50 de 17 nM, 53 nM y 6 nM, respectivamente. Muestra una potente actividad antiproliferativa contra un panel de 39 líneas celulares de cáncer humano con una GI50 media de 0,32 μM, más eficazmente que la de LY294002 o wortmannin con una GI50 media de 7,4 μM o 10 μM, respectivamente. Este tratamiento químico a 1 μM bloquea el ruffling de la membrana y la generación de PIP3 inducida por el factor de crecimiento derivado de plaquetas en fibroblastos embrionarios murinos (MEF). A 10 μM induce la apoptosis en células OVCAR3, e induce la detención completa de la fase G1 pero no la apoptosis en células A549. Este tratamiento con el compuesto a 0,5 μM disminuye significativamente el nivel de Akt y GSK-3β fosforilados, así como la expresión de la proteína ciclina D1. También inhibe la fosforilación de otros componentes de señalización aguas abajo que están implicados en la regulación de la proliferación celular, incluyendo FKHRL1, FKHR, TSC-2, mTOR y p70S6K de una manera dosis-dependiente. [1] Este químico no inhibe mTOR a 0,1 μM, e incluso a una concentración de 100 μM, inhibe la actividad de mTOR en menos del 40%. [2] Bloquea la migración celular inducida por VEGF y la formación de tubos en células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), e inhibe la expresión de HIF-1α y la secreción de VEGF en células RXF-631L, exhibiendo una potente actividad antiangiogénica in vitro. [3] Este tratamiento con el compuesto inhibe la producción de IFNγ e IL-17 en células T activadas por concanavalina A, e inhibe la proliferación y la producción de PGE(2) por células sinoviales similares a fibroblastos (FLS). [6]

• Inhibición de la actividad de PI3K

  Las células A549 se lisan en un tampón que contiene 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA y 1% de Igepal CA-630, los lisados se centrifugan a 20.000 g y 4 °C durante 10 minutos, y los sobrenadantes se utilizan como lisado celular (proteína = 2-4 mg/mL). Para inmunoprecipitar PI3K, se incuban 200 μL de lisado celular con anticuerpo policlonal anti-p85 y agarosa de proteína G (5 μL). Las PI3Kα, PI3Kβ y PI3Kδ pueden ser inmunoprecipitadas por el anticuerpo policlonal anti-p85. Las perlas de agarosa que contienen los inmunoprecipitados se lavan dos veces con el tampón A (20 mM Tris-HCl a pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA y 1% de Igepal CA-630), una vez con el tampón B (500 mM LiCl y 100 mM Tris-HCl a pH 7,5), una vez con agua destilada y una vez con el tampón C (100 mM NaCl y 20 mM Tris-HCl a pH 7,5). Los inmunoprecipitados se suspenden en 20 μL del tampón C que contiene fosfatidilinositol a 200 μg/mL. La mezcla se preincuba con concentraciones crecientes de este compuesto a 25 °C durante 5 minutos. Se añaden [γ-³²P]ATP (2 μCi por mezcla de ensayo; concentración final, 20 μM) y MgCl₂ (concentración final, 20 mM) para iniciar la reacción. La mezcla de reacción se incuba a 25 °C durante 20 minutos. Los productos fosforilados del fosfatidilinositol se separan por cromatografía en capa fina y se visualizan por autorradiografía. La región del fosfatidilinositol-3-fosfato se raspa de la placa, y la radioactividad también se mide con espectroscopia de centelleo líquido. El nivel de inhibición para este químico se determina como el porcentaje de recuentos de ³²P por minuto obtenidos sin este compuesto.

• Líneas celulares

  MCF-7, HT-29, HCT-116, OVCAR3, A549, et al.

• Concentraciones

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~10 μM

• Tiempo de incubación

  48 hours

• Método

  Cells are exposed to increasing concentrations of ZSTK474 for 48 hours. The inhibition of cell proliferation is assessed by measuring changes in total cellular protein by use of a sulforhodamine B assay. Apoptosis is assessed by chromatin condensation or by flow cytometry. For chromatin condensation assay, cells are stained with Hoechst 33342 and examined by fluorescence microscopy. Morphologic changes induced by this compound, such as the condensation of chromatin, are indicative of apoptosis. For flow cytometry analysis, cells are harvested, washed with ice-cold PBS, and fixed in 70% ethanol. Cells are then washed twice with ice-cold PBS again, treated with RNase A (500 μg/mL) at 37 °C for 1 hour, and stained with propidium iodide (25 μg/mL). The DNA content of the cells is analyzed with a flow cytometer.

• Modelos animales

  Male BDF1 mice injected subcutaneously with B16F10 cells, and female BALB/c nude mice inoculated subcutaneously with A549, PC-3, or WiDr cells

• Dosificaciones

  ~400 mg/kg/day

• Administración

  Orally