ZM 447439

In vitro, ZM-447439 inhibe selectivamente las Aurora A y B recombinantes humanas con valores de IC50 de 110 y 130 nM, respectivamente, mientras que otras proteínas quinasas de diversos tipos estructurales, incluidas las quinasas mitóticas CDK1 y PLK1, se inhiben con valores de IC50 >10 μM. [1] El inhibidor de Aurora kinase, ZM-447439, inhibe de forma dependiente del tiempo y la dosis el crecimiento de las tres líneas celulares con valores de IC50 de 3 μM (BON), 0,9 μM (QGP-1) y 3 μM (MIP-101) después de 72 horas de exposición continua. Además, ZM-447439 induce potentemente la apoptosis celular al promover la fragmentación del ADN y la activación de las caspasas 3 y 7, y detiene las células GEP-NET en la fase G₀ /G₁ y G₂/M del Cell Cycle. [2] En el embrión de ratón, la inhibición de la actividad de Aurora kinase por ZM-447439 da como resultado anomalías durante la mitosis al regular la fosforilación de la serina 10 de la histona H3 (H3S10Ph) desde la fase G2 hasta la metafase con diferentes perturbaciones en cada ciclo embrionario. [3] Un estudio reciente muestra que ZM-447439 exhibe un efecto inhibidor del crecimiento y proapoptótico en las células SiHa del cáncer cervical, y mejora la quimiosensibilidad. [4]

• Ensayos de quinasa in vitro

  Las Aurora A y B recombinantes se expresan como proteínas de fusión marcadas con His₆ en el extremo NH₂ utilizando un sistema de expresión de baculovirus. Aurora A se purifica mediante cromatografía de afinidad utilizando agarosa Ni-NTA, y Aurora B se purifica mediante cromatografía de intercambio iónico utilizando CM Sepharose Fast Flow. Se añade 1 ng de enzima recombinante purificada a un cóctel de reacción que contiene 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM KCl, 2,5 mM NaF, 0,6 mM DTT, 6,25 mM MnCl₂, 10 μM de sustrato peptídico, 10 μM para Aurora A o 5 μM de ATP para Aurora B, y 0,2 μCi γ-[³³P]ATP (actividad específica ≥2.500 Ci/mmol), y luego se incuba a temperatura ambiente durante 60 minutos. Las reacciones se detienen mediante la adición de ácido fosfórico al 20 %, y los productos se capturan en filtros de nitrocelulosa P30 y se analizan para la incorporación de ³³P con un contador Betaplate^TM. No se utilizan valores de control sin enzima y sin compuesto para determinar la concentración de ZM447439, que dio una inhibición del 50 % de la actividad enzimática. Hay más detalles disponibles bajo petición a Nicholas Keen.

• Líneas celulares

  BON, QGP-1 and MIP-101 cells

• Concentraciones

  0-5 μM

• Tiempo de incubación

  72 hours

• Método

  Cell number is evaluated by crystal violet staining. In brief, cells in 96-well plates are fixed with 1% glutaraldehyde. Then cells are stained with 0.1% crystal violet. The unbound dye is removed by washing with water. Bound crystal violet is solubilized with 0.2% Triton X-100. Light extinction which increases linearly with the cell number is analyzed at 570 nm using an ELISA reader.