Foretinib

La inhibición de la cinasa se investiga utilizando uno de tres formatos de ensayo: transferencia de [³³P]fosforilo, quimioluminiscencia acoplada a luciferasa o tecnología de Protein Tyrosine Kinase AlphaScreen. Las IC50 se calculan mediante análisis de regresión no lineal utilizando XLFit. Ensayo de Kinasa por Transferencia de ³³P-Fosforilo Las reacciones se realizan en microplacas de 384 pocillos blancas, de fondo claro y de alta unión (Greiner, Monroe, NC). Las placas se recubren con 2 μg/pocillo de proteína o péptido sustrato en un volumen de 50 μL de tampón de recubrimiento que contiene 40 μg/mL de sustrato (poli(Glu, Tyr) 4:1, 22,5 mM Na2CO₃, 27,5 mM NaHCO₃, 50 mM NaCl y 3 mM NaN₃. Las placas recubiertas se lavan una vez con 50 μL de tampón de ensayo después de una incubación nocturna a temperatura ambiente (TA). Los compuestos de prueba y las enzimas se combinan con ³³P-γ-ATP (3,3 μCi/nmol) en un volumen total de 20 μL. La mezcla de reacción se incuba a TA durante 2 horas y se termina por aspiración. Las microplacas se lavan posteriormente 6 veces con tampón Tween-PBS (PBST) al 0,05%. Se añade líquido de centelleo (50 μL/pocillo) y el ³³P incorporado se mide mediante espectrometría de centelleo líquido utilizando un contador de centelleo MicroBeta. Ensayo de Quimioluminiscencia Acoplada a Luciferasa Las reacciones se realizan en microplacas blancas de 384 pocillos de unión media (Greiner). En un primer paso, la enzima y el compuesto se combinan y se incuban durante 60 minutos; las reacciones se inician mediante la adición de ATP y péptido sustrato (poli(Glu, Tyr) 4:1) en un volumen final de 20 μL, y se incuban a TA durante 2-4 horas. Después de la reacción de la cinasa, se añade una alícuota de 20 μL de Kinase Glo (Promega, Madison, WI) y la señal de luminiscencia se mide utilizando un lector de placas Victor. El consumo total de ATP se limita al 50%. Ensayo de Protein Tyrosine Kinase AlphaScreen™ Se utilizan perlas donantes recubiertas con estreptavidina y perlas aceptoras recubiertas con anticuerpo anti-fosfotirosina PY100. Se utiliza poli(Glu,Tyr) 4:1 biotinilado como sustrato. La fosforilación del sustrato se mide mediante la adición de perlas donantes/aceptoras por luminiscencia después de la formación del complejo de perlas donantes-aceptoras. La cinasa y los compuestos de prueba se combinan y se preincuban durante 60 minutos, seguido de la adición de ATP y poli(Glu, Tyr) biotinilado en un volumen total de 20 μL en microplacas blancas de 384 pocillos de unión media (Greiner). Las mezclas de reacción se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. Las reacciones se detienen mediante la adición de 10 μL de 15-30 μg/mL de suspensión de perlas AlphaScreen que contiene 75 mM Hepes, pH 7,4, 300 mM NaCl, 120 mM EDTA, 0,3% BSA y 0,03% Tween-20. Después de 2-16 horas de incubación a temperatura ambiente, las placas se leen utilizando un lector AlphaQuest.

B16F10, A549, and HT29 cells

40 nM

12 to 14 days

B16F10, A549, and HT29 cells (1.2× 10³ per well) are mixed with soft agar and seeded in a 96-well plate containing 10% FBS and EXEL-2880 over a base agar layer. For normoxic conditions, the plates are incubated (37°C) for 12 to 14 days in 21% oxygen, 5% CO₂, and 74% nitrogen, whereas incubation (37 °C) under hypoxic conditions is done in a hypoxia chamber in 1% oxygen, 5% CO₂, and 94% nitrogen. The number of colonies is evaluated under each condition following addition of 50% Alamar Blue and fluorescence detection.

B16F10 tumor cells (2 × 10 ⁵) are implanted via i.v. tail vein injection into athymic nude mice (NCr or BALB/c) 5 to 8 weeks old

100 mg/kg

Administered via oral gavage