VX-809 (Lumacaftor)

Lumacaftor (VX-809) actúa a nivel del RE para permitir que una fracción del F508del-CFTR adopte una forma correctamente plegada, salga del RE y se movilice hacia la superficie celular para un funcionamiento normal. En células tiroideas de rata Fischer (FRT) que expresan F508del-CFTR, el tratamiento con este compuesto mejora significativamente la maduración del F508del-CFTR en 7,1 veces con una EC50 de 0,1 μM, y mejora el transporte de cloruro mediado por F508del-CFTR en aproximadamente 5 veces con una EC50 de 0,5 μM, mientras que VRT-768 tiene valores de EC50 más altos de 7,9 μM y 16 μM, respectivamente. En células HEK-293 que expresan F508del-CFTR, (3 μM) aumenta la salida de F508del-CFTR del RE en 6 veces, alcanzando niveles comparables al 34% de CFTR. En células epiteliales bronquiales humanas primarias (HBE) con mutación F508del-CFTR, el agente aumenta la maduración de CFTR y mejora la secreción de cloruro con EC50 de 350 nM y 81 nM, respectivamente, siendo más eficaz que Corr-4a y VRT-325. El F508del-CFTR corregido por él exhibe una probabilidad de apertura de canal único de 0,39 similar al CFTR normal de 0,40. A diferencia de VX-770, no es un potenciador de CFTR, ya que la adición aguda no tiene efecto sobre la función de F508del-CFTR. A diferencia de VRT-325 y Corr-4a, no mejora el procesamiento de las formas normales o mutantes de hERG o P-gp, así como de otras proteínas mal localizadas causantes de enfermedades, incluyendo el mutante α1-antitripsina Z (E342K-α1-AT) o N370S-β-glucosidasa, lo que sugiere que es específico para CFTR. En combinación con VRT-325 o Corr-4a tiene un efecto aditivo sobre el transporte de cloruro mediado por CFTR en células F508del-HBE cultivadas. [1]

Lumacaftor (VX-809; VRT 826809) es un modulador de CFTR que corrige el plegamiento y el tráfico de la proteína CFTR.

• maduración del F508del-CFTR

  Las células FRT que expresan de forma estable F508del-CFTR se tratan con concentraciones crecientes de Lumacaftor (VX-809) durante 48 horas. Después de la incubación, las células se recolectan en solución D-PBS fría (sin calcio ni magnesio) y se centrifugan a 1.000 × g a 4 °C. Los pellets celulares se lisan en 1% de Nonidet P-40, 0,5% de desoxicolato de sodio, 200 mM de NaCl, 10 mM de Tris, pH 7,8, y 1 mM de EDTA más una mezcla de inhibidores de proteasas (1:250) durante 30 minutos en hielo. Los lisados se centrifugan durante 10 minutos a 10.000 × g a 4 °C para sedimentar los núcleos y el material insoluble. Aproximadamente 12 μg de proteína total se calientan en tampón de Laemmli con 5% de β-mercaptoetanol a 37 °C durante 5 minutos y se cargan en un gel de Tris-acetato del 3% al 8%. El gel se transfiere a nitrocelulosa y se procesa para Western blotting utilizando un anticuerpo monoclonal CFTR o policlonal contra GAPDH. Las membranas se revelan mediante quimioluminiscencia mejorada. La cuantificación de las cantidades relativas de las bandas C y GAPDH se realiza utilizando el análisis NIH ImageJ de las películas escaneadas.

• Líneas celulares

  FRT (CFTR or F508del-CFTR), HEK-293 (CFTT or F508del-CFTR) , and HBE cells

• Concentraciones

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~0.1 mM

• Tiempo de incubación

  24 or 48 hours

• Método

  Cells are exposed to various concentrations of Lumacaftor (VX-809) for 24 or 48 hours. Ussing chamber techniques are used to record the transepithelial current (I_T) resulting from CFTR-mediated chloride transport. The single-channel activity of CFTR is measured by using excised inside-out membrane patch recordings. Immunoblot techniques using the monoclonal CFTR antibody are used to measure CFTR maturation in FRT, HEK-293, or HBE cells expressing CFTR or F508del-CFTR.

• Modelos animales

  Male Sprague– Dawley rats

• Dosificaciones

  1 mg/kg

• Administración

  p.o.