Tandutinib (MLN518)

Tandutinib (MLN518) tiene poca actividad contra EGFR, FGFR, KDR, InsR, Src, Abl, PKC, PKA y MAPK. Inhibe el crecimiento celular independiente de IL-3 y la autofosforilación de FLT3-ITD con una IC50 de 10-100 nM. Este compuesto también inhibe la proliferación de células de leucemia humana Ba/F3 que contienen mutaciones FLT3-ITD con valores de IC50 de 10-30 nM, y las células Molm-13 y Molm-14 FLT3-ITD-positivas con una IC50 de 10 nM. En células Molm-14 FLT3-ITD-positivas, pero no en células THP-1 FLT3-ITD-negativas, el tratamiento con Tandutinib conduce a una apoptosis significativa del 51% y 78% a las 24 y 96 horas, respectivamente, debido a la inhibición específica de FLT3. [1] Inhibe preferentemente el crecimiento de colonias blásticas de pacientes con LMA FLT3 ITD-positivos en comparación con los ITD-negativos, sin afectar la formación de colonias por células progenitoras humanas normales. [2]

La administración oral de Tandutinib (MLN518) a 60 mg/kg bid aumenta significativamente la supervivencia en ratones portadores de células Ba/F3 que expresan el mutante W51 FLT3-ITD, y produce una reducción significativa de la mortalidad en un modelo de trasplante de médula ósea en ratones. [1] El tratamiento con este compuesto a 180 mg/kg dos veces al día tiene una leve toxicidad para la hematopoyesis normal, sin embargo, es una dosis a la que es eficaz para tratar la leucemia FLT3 ITD-positiva en ratones. [2]

• Ensayos de autofosforilación de receptores basados en células

  Los ensayos de autofosforilación de la quinasa de la familia PDGFR son ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) basados en células utilizando células CHO que expresan PDGFRβ de tipo salvaje, la proteína quimérica PDGFRβ/c-Kit y PDGFRβ/Flt3 que contienen los dominios extracelular y transmembrana de PDGFRβ y el dominio citoplasmático de c-Kit, y Flt-3. Las células se cultivan hasta confluencia en placas de microtitulación de 96 pocillos en condiciones estándar de cultivo de tejidos, seguido de privación de suero durante 16 horas. Brevemente, las células quiescentes se incuban a 37 °C con concentraciones crecientes de Tandutinib (MLN518) durante 30 minutos, seguido de la adición de 8 nM de PDGF-BB durante 10 minutos. Las células se lisan en 100 mM Tris, pH 7.5, 750 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 10 mM pirofosfato de sodio, 50 mM NaF, 10 μg/mL leupeptina, 1 mM fenilmetilsulfonil fluoruro, 1 mM vanadato de sodio, y el lisado se aclara por centrifugación a 15,000g durante 5 minutos. Los lisados clarificados se transfieren a una segunda placa de microtitulación en la que los pocillos han sido previamente recubiertos con 500 ng/pocillo de mAb anti-PDGFRβ 1B5B11 y luego se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con tampón de unión (0.3% gelatina, 25 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.01% Tween 20), se añaden 250 ng/mL de anticuerpo policlonal anti-fosfotirosina de conejo y las placas se incuban a 37 °C durante 60 minutos. Posteriormente, cada pocillo se lava tres veces con tampón de unión y se incuba con 1 μg/mL de anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano a 37 °C durante 60 minutos. Los pocillos se lavan antes de añadir 2,2

• Líneas celulares

  Ba/F3, Molm-13, Molm-14, HL60, AML193, KG-1, KG-1a, THP-1, and RS4;11

• Concentraciones

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~30 μM

• Tiempo de incubación

  ~7 days

• Método

  Cells are exposed to increasing concentrations of Tandutinib (MLN518) (0.004-30 μM). They are grown for 3-7 days in tissue culture, and viable cells, determined by Trypan blue dye exclusion, are counted. At daily intervals, cells are harvested, washed, and resuspended in 100 uL binding buffer containing 10 mM HEPES (pH 7.4), 140 mM NaCl, and 2.5 mM CaCl₂. Annexin V-FITC (100 ng) and propidium iodide (250 ng) are added to the cell suspension followed by incubation at room temperature for 15 minutes. Flow cytometry is performed immediately after staining on a FACSort flow cytometer with excitation at 488 nm. Fluorescence of annexin V-FITC and DNA propidium iodide staining are measured at 515 nm and 585 nm, respectively.

• Modelos animales

  Female athymic nude (nu/nu) mice injected with Ba/F3 cells expressing W51 FLT3-ITD mutant

• Dosificaciones

  40-120 mg/kg/day

• Administración

  Orally by gavage