Raltegravir

Para los ensayos cuantitativos de transferencia de hebra, el sustrato de ADN donante se forma mediante el recocido de oligonucleótidos de grado HPLC 5′-GACTCACTATAGGGCACGCGTCAAAATTCCATGACA y 5′-ATTGTCATG GAATTTTGACGCGTGCCCTATAGTGAGTC. Las reacciones (40 μL) contienen 0,75 μM de PFV IN, 0,75 μM de ADN donante, 4 nM (300 ng) de ADN diana pGEM9-Zf(−) superenrollado, 125 mM de NaCl, 5 mM de MgSO₄, 4 μM de ZnCl₂, 10 mM de DTT, 0,8 % (vol/vol) de DMSO y 25 mM de BisTris propano–HCl, pH 7,45. Se añade Raltegravir en las concentraciones indicadas. Las reacciones se inician añadiendo 2 μL de PFV IN diluida en 150 mM de NaCl, 2 mM de DTT y 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4, y se detienen después de 1 hora a 37 °C añadiendo 25 mM de EDTA y 0,5 % (p/v) de SDS. Los productos de la reacción, desproteinizados por digestión con 20 μg de proteinasa K durante 30 minutos a 37 °C, seguidos de precipitación con etanol, se separan en geles de agarosa al 1,5 % y se visualizan mediante tinción con bromuro de etidio. Los productos de integración se cuantifican mediante PCR cuantitativa en tiempo real, utilizando Platinum SYBR Green qPCR SuperMix y tres cebadores: 5′-CTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAAC, 5′-TTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAAC y 5′-GACTCACTATAGGGCACGCGT. Las reacciones de PCR (20 μL) contenían 0,5 μM de cada cebador y 1 μL de producto de reacción de integración diluido. Tras un paso de desnaturalización de 5 minutos a 95 °C, se realizan 35 ciclos en un instrumento de PCR CFX96, utilizando 10 segundos de desnaturalización a 95 °C, 30 segundos de anillamiento a 56 °C y 1 minuto de extensión a 68 °C. Las curvas estándar se generan utilizando diluciones en serie de la reacción de PFV IN WT en ausencia de este compuesto.

Human MT-4 cells

0.0001-1 μM

5 days

Human MT-4 cells are infected for 2 hours with the SIVmac251, HIV-1 (IIIB) and HIV-2 (CDC 77618) stocks at a multiplicity of infection of, approximately, 0.1. Cells are then washed three times in phosphate buffered saline, and suspended at 5 × 10⁵/mL in fresh culture medium (to primary cells 50 units/mL of IL-2 are added) in 96-well plates, in the presence or absence of a range of triplicate raltegravir concentrations (0.0001 μM -1 μM). Untreated infected and mock-infected controls are prepared too, in order to allow comparison of the data derived from the different treatments. Viral cytopathogeniciy in MT-4 cells is quantitated by the methyl tetrazolium (MTT) method (MT-4/MTT assay) when extensive cell death in control virus-infected cell cultures is detectable microscopically as lack of capacity to re-cluster. The capability of MT-4 cells to form clusters after infection. Briefly, clusters are disrupted by pipetting; and, after 2 hours of incubation at 37 °C, the formation of new clusters is assessed by light microscopy (100 × magnification). Cell culture supernatants are collected for HIV-1 p24 and HIV-2/SIVmac251 p27 core antigen measurement by ELISA. In CEMx174-infected cell cultures, which show a propensity to form syncytia induced by the virus envelope glycoproteins, syncytia are counted, in blinded fashion, by light microscopy for each well at 5 days following infection.

Indian Rhesus macaques

50 mg/kg or 100 mg/kg

Oral administration