Pemetrexed Disodium (LY231514)

La actividad de la TS se evalúa utilizando un método espectrofotométrico, que implica el seguimiento del aumento de la absorbancia a 340 nm resultante de la formación del producto, 7,8-dihidrofolato. El tampón de ensayo contiene 50 mM de ácido N-tris[hidroximetil]metil-2-aminoetanosulfónico, 25 mM de MgC1₂, 6,5 mM de formaldehído, 1 mM de EDTA y 75 mM de 2-mercaptoetanol, pH 7,4. Las concentraciones de desoxiuridilato monofosfato, 6R-MTHF y hIS son de 100 μM, 30 μM y 30 nM (1,7 miliunidades/mL), respectivamente. A la concentración de 6R-MTHF, se ensayan una reacción no inhibida y seis concentraciones de inhibidor. Los valores de K_{i app} se determinan ajustando los datos a la ecuación de Morrison utilizando un análisis de regresión no lineal con la ayuda del programa ENZFITTER. Los valores de K_i se calculan utilizando la ecuación: K_{i app}= K_i(1 + [S]/K_m), donde [S] es igual a 30 μM y K_m es igual a 3 μM. La actividad de la DHFR se ensaya espectrofotométricamente monitorizando la desaparición de los sustratos NADPH y 7,8-dihidrofolato a 340 nm. La reacción tiene lugar a 25°C en 0,5 mL de tampón de fosfato de potasio 50 mM, que contiene 150 mM de KC1 y 10 nM de 2-mercaptoetanol, pH 7,5, y 14 nM (0,34 miliunidad/mL) de DHFR. La concentración de NADPH es de 10 μM y el 7,8-dihidrofolato se varía a 5, 10 o 15 μM. A cada concentración de 7,8-dihidrofolato, se ensayan una reacción no inhibida y siete concentraciones de inhibidor. El programa de microcomputadora ENZFITI'ER se utiliza para obtener los valores de K_{i app} ajustando los datos a la ecuación de Morrison mediante análisis de regresión no lineal. K_{i app}= K_i(1 + [S]/K_m), donde [S] es igual a la concentración de 7,8-dihidrofolato utilizada y K_m de 7,8-dihidrofolato es igual a 0,15 μM. La actividad de la GARFT se ensaya espectrofotométricamente monitorizando el aumento de la absorbancia resultante de la formación del producto 5,8-dideazafolato a 295 nm. El disolvente de reacción contiene 75 mM de HEPES, 20% de glicerol y 50 mM de a-tioglicerol, pH 7,5, a 25°C. Las concentraciones de sustratos y enzimas utilizadas son 10 μM de α,β-glicinamida ribonucleótido, 0-10 μM de ácido 10-formil-5,8-dideazafólico y 10 nM (1,9 miliunidades/mL) de GARFT. Los valores de K_i se calculan utilizando el programa de Mecanismo Enzimático del espectrofotómetro Beckman DU640, que utiliza análisis de regresión no lineal para ajustar los datos a la ecuación de Michaelis-Menten para la inhibición competitiva.

CCRF-CEM leukemia, GC3/C1 colon carcinoma, and HCT-8 ileocecal carcinoma cells.

0-30 μM

72 hours

Dose-response curves are generated to determine the concentration required for 50% inhibition of growth (IC50). Pemetrexed disodium is dissolved initially in DMSO at a concentration of 4 mg/mL and further diluted with cell culture medium to the desired concentration. CCRF-CEM leukemia cells in complete medium are added to 24-well Cluster plates in a total volume of 2.0 mL. This compound at various concentrations are added to duplicate wells so that the final volume of DMSO is 0.5%. The plates are incubated for 72 hour at 37 °C in an atmosphere of 5% CO₂ in air. At the end of the incubation, cell numbers are determined on a ZBI Coulter counter. For several studies, IC50s are determined for each compound in the presence of either 300 μM AICA, 5 μM thymidine, 100 μM hypoxanthine, or combination of 5 μM hymidine plus 100 μM hypoxanthine. For adherent tumor cells, a modification of the original MTT colorimetric assay is used to measure cell cytotoxicity. The human tumor cells are seeded in 100 μL assay medium/well in 96-well flat-bottomed tissue culture plates. The assay medium contains folic acid-free RPMI 1640 supplemented with 10% FCS and either 2 nM folinic acid or 2.3 μM folic acid as the sole folate source. Well 1A is left blank. Stock solutions of antifolates are prepared in Dulbecco's PBS at 1 mg/mL, and a series of 2-fold dilutions are subsequently made in PBS. Ten-μL aliquots of each concentration are added to triplicate wells. Plates are incubated for 72 hours at 37 °C in a humidified atmosphere of 5% CO₂-in-air. MTT is dissolved in PBS at 5 mg/mL, 10 μL of stock MTF solution are added to each well of an assay, and the plates are incubated at 37 °C for 2 additional hours. Following incubation, 100 μL of DMSO are added to each well. After thorough formazan solubilization, the plates are read on a Dynatech MR600 reader, using a test wavelength of 570 nm and a reference wavelength of 630 nm. The IC50 is determined as the concentration of drug required to inhibit cell growth by 50% compared to an untreated controls.

EMT-6 mammary carcinoma, the human HCT 116 colon carcinoma, and the human H460 non-small cell lung carcinoma are injected s.c. into the nude mice.

100 mg/kg or 150 mg/kg

Administered via i.p.