PF-02341066 (Crizotinib)

PF-2341066 muestra una potencia similar contra la fosforilación de c-Met en células epiteliales de ratón mIMCD3 o de perro MDCK con IC50 de 5 nM y 20 nM, respectivamente. Este compuesto muestra una actividad mejorada o similar contra células NIH3T3 diseñadas para expresar los mutantes del sitio de unión a ATP de c-Met V1092I o H1094R o el mutante del bucle P M1250T con IC50 de 19 nM, 2 nM y 15 nM, respectivamente, en comparación con células NIH3T3 que expresan el receptor de tipo salvaje con IC50 de 13 nM. En contraste, se observa un marcado cambio en la potencia de este compuesto contra células diseñadas para expresar los mutantes del bucle de activación de c-Met Y1230C e Y1235D con IC50 de 127 nM y 92 nM, respectivamente, en comparación con el receptor de tipo salvaje. También previene potentemente la fosforilación de c-Met en células NCI-H69 y HOP92, con IC50 de 13 nM y 16 nM, respectivamente, que expresan las variantes endógenas de c-Met R988C y T1010I, respectivamente. Este compuesto es >1.000 veces selectivo para los RTK VEGFR2 y PDGFRβ, >250 veces selectivo para IRK y Lck, y ~40 a 60 veces selectivo para Tie2, TrkA y TrkB, todo en comparación con c-Met. Es 20 a 30 veces selectivo para los RTK RON y Axl. En contraste, este compuesto muestra una IC50 casi equivalente de 24 nM contra la variante de fusión oncogénica nucleofosmina (NPM)-cinasa de linfoma anaplásico (ALK) del RTK ALK expresado por la línea celular de linfoma anaplásico de células grandes humano (ALCL) KARPAS299. Inhibe los fenotipos neoplásicos dependientes de c-Met de las células cancerosas y los fenotipos angiogénicos de las células endoteliales. Este químico suprime el crecimiento de células de carcinoma gástrico humano GTL-16 con una IC50 de 9,7 nM. Induce la apoptosis en células GTL-16 con una IC50 de 8,4 nM. Inhibe la migración e invasión de células de carcinoma pulmonar humano NCI-H441 estimuladas por HGF con IC50 de 11 nM y 6,1 nM, respectivamente. Inhibe la dispersión de células MDCK con una IC50 de 16 nM. Previene la fosforilación de c-Met, la supervivencia celular y la invasión de Matrigel estimuladas por HGF con IC50 de 11 nM, 14 nM y 35 nM, respectivamente. Además, previene la tubulogénesis de ramificación de HMVEC estimulada por suero (formación de tubos vasculares) en geles de fibrina. [1] También inhibe potentemente la fosforilación de NPM-ALK en células ALCL Karpas299 o SU-DHL-1 con una IC50 de 24 nM. Este compuesto previene potentemente la proliferación celular, que se asocia con la detención del ciclo celular en fase G(1)-S y la inducción de apoptosis en células ALCL ALK-positivas con IC50 de 30 nM, pero no en células de linfoma ALK-negativas. [2] Además, previene el comportamiento de osteosarcoma asociado con el crecimiento tumoral primario (es decir, proliferación y supervivencia), así como con la metástasis (p. ej., invasión y clonogenicidad). [3]

En el modelo GTL-16, PF-2341066 revela la capacidad de causar una marcada regresión de grandes tumores establecidos (>600 mm³) tanto en las cohortes de tratamiento de 50 mg/kg/día como de 75 mg/kg/día, con una disminución del 60% en el volumen tumoral medio durante el programa de administración de 43 días. En otro estudio, este compuesto muestra la capacidad de inhibir completamente el crecimiento tumoral de GTL-16 durante >3 meses, con solo 1 de cada 12 ratones que exhibe un aumento significativo en el crecimiento tumoral durante el programa de tratamiento de 3 meses a 50 mg/kg/día. En el modelo de NSCLC NCI-H441, se observa una disminución del 43% en el volumen tumoral medio a 50 mg/kg/día durante el ciclo de administración de PF-2341066 de 38 días. En el modelo de CCR Caki-1, se observa una disminución del 53% en el volumen tumoral medio asociada con una disminución del volumen de cada tumor en al menos un 30% a 50 mg/kg/día durante el ciclo de administración de PF-2341066 de 33 días. Este compuesto también revela una prevención casi completa del crecimiento de tumores establecidos a 50 mg/kg/día en los modelos de xenoinjertos de glioblastoma U87MG o carcinoma de próstata PC-3, con una inhibición del 97% u 84% en el último día del estudio, respectivamente. En contraste, este químico administrado por vía oral a 50 mg/kg/día no inhibe significativamente el crecimiento tumoral en el modelo de carcinoma de mama MDA-MB-231, o el modelo de carcinoma de colon DLD-1. Se observa una reducción significativa dependiente de la dosis de células endoteliales positivas a CD31 a 12,5 mg/kg/día, 25 mg/kg/día y 50 mg/kg/día en tumores GTL-16, lo que indica que la inhibición de la MVD muestra una correlación dependiente de la dosis con la eficacia antitumoral. Este compuesto muestra una reducción significativa dependiente de la dosis de los niveles plasmáticos humanos de VEGFA e IL-8 en los modelos GTL-16 y U87MG. Se observa una marcada inhibición de los niveles fosforilados de c-Met, Akt, Erk, PLCλ1 y STAT5 en tumores GTL-16 después de la administración oral de este compuesto.[1] La administración oral de este químico a ratones SCID-Beige con xenoinjertos tumorales de ALCL Karpas299 conduce a una eficacia antitumoral dependiente de la dosis con regresión completa de todos los tumores a la dosis de 100 mg/kg/día dentro de los 15 días posteriores a la administración inicial del compuesto. Además, la inhibición de mediadores clave de la señalización NPM-ALK, incluida la fosfolipasa C-gamma, los transductores de señal y activadores de la transcripción 3, las quinasas reguladas por señales extracelulares y Akt por este compuesto se observa en concentraciones o niveles de dosis, que se correlacionaron con la inhibición de la fosforilación y función de NPM-ALK.[2] Este compuesto previene el comportamiento de osteosarcoma asociado con el crecimiento tumoral primario (p. ej., proliferación y supervivencia) así como con la metástasis (p. ej., invasión y clonogenicidad). En ratones desnudos tratados con este químico mediante sonda oral, el crecimiento y la osteólisis asociada y la formación de matriz ósea extracortical de los xenoinjertos de osteosarcoma son prevenidos por este compuesto.[3] El tratamiento de xenoinjertos GTL-16 amplificados en c-MET con 50 mg/kg de este compuesto provoca una regresión tumoral que se asocia con una lenta reducción en la captación de ¹⁸F-FDG y disminuye la expresión del transportador de glucosa 1, GLUT-1.[4]

• Ensayos ELISA de fosforilación de quinasas celulares

  Las células se siembran en placas de 96 pocillos en medios suplementados con 10% de suero fetal bovino (SFB) y se transfieren a medios libres de suero [con 0,04% de albúmina sérica bovina (BSA)] después de 24 h. En experimentos que investigan la fosforilación de RTK dependiente del ligando, se añaden los factores de crecimiento correspondientes durante un máximo de 20 min. Después de la incubación de las células con este compuesto durante 1 h y/o ligandos apropiados durante los tiempos designados, las células se lavan una vez con HBSS suplementado con 1 mM de Na₃VO₄, y se generan lisados de proteínas a partir de las células. Posteriormente, la fosforilación de las proteínas quinasas seleccionadas se evalúa mediante un método ELISA de tipo sándwich utilizando anticuerpos de captura específicos utilizados para recubrir placas de 96 pocillos y un anticuerpo de detección específico para residuos de tirosina fosforilados. Las placas recubiertas de anticuerpos se (a) incuban en presencia de lisados de proteínas a 4°C durante toda la noche; (b) se lavan siete veces en 1% de Tween 20 en PBS; (c) se incuban en un anticuerpo anti-total-fosfotirosina (PY-20) conjugado con peroxidasa de rábano (1:500) durante 30 min; (d) se lavan siete veces más; (e) se incuban en sustrato de peroxidasa de 3,3′,5,5′-tetrametilbencidina para iniciar una reacción colorimétrica que se detiene añadiendo 0,09 N H₂SO₄; y (f) se mide la absorbancia a 450 nm utilizando un espectrofotómetro.

• Líneas celulares

  GTL-16 gastric carcinoma cells and T47D breast carcinoma cells

• Concentraciones

  0-256 nM

• Tiempo de incubación

  1 hour

• Método

  Cells including GTL-16 gastric carcinoma cells and T47D breast carcinoma cells are seeded in 96-well plates in media supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and transferred to serum-free media [with 0.04% bovine serum albumin (BSA)] after 24 hours. In experiments investigating ligand-dependent RTK phosphorylation, corresponding growth factors are added for up to 20 minutes. After incubation of cells with this compound for 1 hour and/or appropriate ligands for the designated times, cells are washed once with HBSS supplemented with 1 mM Na₃VO₄, and protein lysates are generated from cells. Subsequently, phosphorylation of selected protein kinases is assessed by a sandwich ELISA method using specific capture antibodies used to coat 96-well plates and a detection antibody specific for phosphorylated tyrosine residues. Antibody-coated plates are (a) incubated in the presence of protein lysates at 4 °C overnight; (b) washed seven times in 1% Tween 20 in PBS; (c) incubated in a horseradish peroxidase–conjugated anti–total-phosphotyrosine (PY-20) antibody (1:500) for 30 min; (d) washed seven times again; (e) incubated in 3,3^′,5,5^′-tetramethyl benzidine peroxidase substrate to initiate a colorimetric reaction that is stopped by adding 0.09 N H₂SO₄; and (f) measured for absorbance in 450 nm using a spectrophotometer.

• Modelos animales

  Female or male nu/nu mice bearing NCI-H441,or DLD-1, or MDA-MB-231

• Dosificaciones

  12.5 mg/kg/day, 25 mg/kg/day, and 50 mg/kg/day

• Administración

  Administered via p.o.