OSI-027

OSI-027 muestra actividades de inhibición selectivas y competitivas del ATP contra mTORC1 y mTORC2 con una IC50 de 22 nM y 65 nM, respectivamente. Además, este compuesto inhibe la señalización de mTOR de fosfo-4E-BP1 con una IC50 de 1 μM en ensayos basados en células. [1] Exhibe actividades antiproliferativas contra varias líneas celulares de leucemia aguda de origen mieloide/megacariocítico de manera dosis-dependiente, incluyendo células U937, KG-1, KBM-3B, ML-1, HL-60 y MEG-01. [2] Un estudio reciente muestra que la inhibición de mTORC1/2 por este químico suprime eficazmente la fosforilación de Akt (S473) y la proliferación celular en células de cáncer de mama. [3]

En el xenoinjerto colorrectal GEO, OSI-027 (65 mg/kg) inhibe los efectores de mTORC1 y mTORC2, incluyendo la fosforilación de 4E-BP1, Akt y S6. Además, la inhibición conjunta de mTORC1 y mTORC2 por este compuesto inhibe potentemente el crecimiento tumoral más que la inhibición de mTORC1 por rapamicina. [1]

• Ensayos bioquímicos

  La inhibición de mTORC1 y mTORC2 se ensaya utilizando un complejo enzimático nativo inmunoprecipitado de lisados de HeLa a 1 mM de ATP. Para preparar lisados celulares completos de células HeLa, 25 g de pellet celular se lisan en 60 ml de tampón A frío [40 mM HEPES (pH 7,5), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM pirofosfato de sodio, 10 mM glicerofosfato, 50 mM NaF, 0,5 mM ortovanadato e inhibidores de proteasas libres de EDTA que contienen 0,3 % de CHAPS] durante 30 minutos en un agitador magnético en una sala fría. Después de la clarificación de los lisados por centrifugación a 13.000 g durante 10 minutos, las placas de 384 pocillos recubiertas con proteína G se incuban con 0,25 μg de anticuerpo mTOR en 15 μL de tampón A durante 1 hora a 4 °C. A cada pocillo se le añaden 40 μg de lisado celular de HeLa en 15 μL de tampón A y se incuban durante la noche a 4 °C para inmunoprecipitar los complejos mTOR. Las placas se lavan 3 veces con tampón A y dos veces con tampón de lavado de inmunoprecipitación [Tampón B: 50 mM HEPES (pH 7,5) y 150 mM NaCl]. OSI-027 se añade a una concentración de 10 μM a cada pocillo y se añade DMSO a los pocillos de control. La reacción se inicia añadiendo 150 ng de 4E-BP1 con etiqueta His como sustrato en presencia o ausencia de 100 μM de ATP a cada pocillo en 25 μL de tampón de quinasa recién preparado [Tampón C: 20 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 4 mM MnCl₂, 10 mM β-mercaptoetanol y 200 μM de vanadato] y se incuba a temperatura ambiente (TA) durante 30 minutos. La reacción se detiene transfiriendo 25 μL de mezcla de reacción de cada pocillo a los pocillos correspondientes de placas frescas recubiertas con quelato de Ni y se incuba durante la noche a 4 °C, seguida de 2 horas a 37 °C. Para detectar la fosforilación de 4E-BP1, las placas se lavan una vez con TBST (solución salina tamponada con Tris que contiene 0,1 % de Tween-20) que contiene 5 % de leche desnatada en polvo. A cada pocillo, se añaden 25 μL de anticuerpos fosfo-4E-BP1 diluidos 1:1.000 en TBST que contiene 5 % de leche desnatada y se incuban durante 1 hora a TA. Las placas se lavan una vez con TBST y luego se añaden 25 μL de HRP anti-conejo (diluido 1:10.000) en TBST que contiene 5 % de leche desnatada. Las placas se incuban durante 1 hora a TA y se lavan 5 veces con TBST. Para la detección de fosfo-4E-BP1, se añaden 25 μL de reactivos quimioluminiscentes A+B y la quimioluminiscencia se mide utilizando un lector de placas Analyst.

• Líneas celulares

  U937, KG-1, KBM-3B, ML-1, HL-60, and MEG-01

• Concentraciones

  0-10 μM

• Tiempo de incubación

  72 hours

• Método

  Inhibition of proliferation is measured using the Cell Titer Glo Assay , as noted in figure legends. To generate dose–response curves, cell lines are seeded at a density of 5,000 cells per well in a 96-well plate. After 24 hours of plating, cells are dosed with varying concentrations of either OSI-027 or this compound. The signal for Cell Titer Glo Assay is determined 72 hours after dosing and normalized to that of vehicle-treated controls. Inhibition of proliferation, relative to vehicle-treated controls, is expressed as a fraction of 1 and graphed using PRISM software.

• Modelos animales

  GEO colorectal cells are injected s.c. into the right flank of nu/nu CD-1 mice.

• Dosificaciones

  ≤65 mg/kg

• Administración

  Administered via gavage.