Zosuquidar 3HCl

LY335979 inhibe competitivamente la unión en equilibrio de Pgp al bloquear el marcaje por fotoafinidad con [³H]azidopina de la Pgp en membranas plasmáticas de CEM/VLB₁₀₀. [1] LY335979 solo muestra citotoxicidad en líneas celulares sensibles a fármacos y MDR con IC50 que oscilan entre 6 μM y 16 μM y produce su capacidad para revertir completamente la resistencia de los oncolíticos a las líneas celulares MDR P388/ADR, MCF7/ADR, 2780AD o UCLA-P3.003VLB a una concentración de 0,1 y 0,5 μM. [1] LY335979 restaura significativamente la sensibilidad a los fármacos en líneas celulares de leucemia que expresan P-gp, incluyendo K562/HHT40, K562/HHT90, K562/DOX y HL60/DNR, y mejora la citotoxicidad de las antraciclinas y la ozogamicina (Mylotarg) en blastos primarios de LMA con P-gp activa. [2] Un artículo reciente indica que LY335979 inhibe completamente el transporte dirigido apicalmente de (Z)-endoxifeno en las células transducidas con ABCB1. [3]

• Ensayo de ATPasa

  La actividad ATPasa de la P-glicoproteína se mide por la liberación de fosfato inorgánico del ATP. El ensayo se realiza en una placa de 96 pocillos durante 90 min a 37 °C. Las membranas (8 μg-10 μg de proteína) se incuban en un volumen total de 100 μL de tampón A que contiene 5 mM de azida de sodio, 1 mM de ouabaína, 1 mM de EGTA, 3 mM de ATP, un sistema de regeneración de ATP compuesto por 5 mM de fosfoenolpiruvato y 3,6 unidades/mL de piruvato quinasa en presencia y ausencia de 1 mM de vanadato de sodio. La actividad ATPasa de la Pgp se define como la porción de la actividad ATPasa total sensible al vanadato. Las placas se leen 3 minutos después de la adición de la solución de detección. La absorbancia se mide a 690 nm con un lector de microplacas. Se utiliza una curva estándar de fosfato para calcular los μmol de fosfato formado. Las muestras se miden por triplicado.

• Líneas celulares

  CEM/VLB₁₀₀, P388/ADR, MCF7/ADR, 2780AD, and UCLA-P3.OO3VLB cells

• Concentraciones

  0.05 μM to 5 μM

• Tiempo de incubación

  72 hours

• Método

  Cell viability is determined using a modified the MTT dye reduction method. Cells are harvested during logarithmic growth phase, and seeded in 96-well plates. The cells are then cultured for 72 hours in the presence of oncolytics with or without modulators. MCF-7 and MCF-7/ADR cells are incubated 24 hours before the addition of the drug with and without the LY335979. LY335979 is prepared as 2 mM DMSO stocks and added to wells to give final concentrations ranging from 0.05 to 5 μM. After 72 hours, 20 μL of freshly prepared MTT(5 mg/mL in Dulbecco's PBS) is added to each well and incubated for 4 hours in a 37 °C incubator containing 5% CO₂. Cells are pelleted in a Sorvall RT6000B centrifuge, 70 μL of medium is carefully removed from each well, and 100 μL of 2-propanol/0.04 N HC1 is added. Cells are resuspended 5-10 times with a Multipipettor or until no particulate matter is visible. Plates are immediately read on a Titertek Multiskan MCC/340 microplate reader Flow Laboratories with a test wavelength of 570 nm and a reference wavelength of 630 nm. Controls are measured in quadruplicate and modulators are measured in duplicate. Cytotoxicity analyses are also performed using the CeliTiter 96 AQueous assay kit.

• Modelos animales

  P388 or P388/ADR cells are implanted by i.p. injection into female BDF₁ mice.

• Dosificaciones

  ≤30 mg/kg

• Administración

  Administered via i.p. and i.v.