KU-0063794

En comparación con el inhibidor de mTOR PP242, KU-0063794 exhibe una mayor especificidad para mTOR, siendo inactivo contra PI3Ks u otras 76 quinasas. En células HEK-293, este compuesto a 30 nM es suficiente para eliminar rápidamente la actividad de S6K1 al bloquear la fosforilación del motivo hidrofóbico (Thr³⁸⁹) y, posteriormente, la fosforilación del residuo del bucle T (Thr²²⁹). En el caso de la estimulación con IGF1 de células HEK-293 privadas de suero, se necesitan 300 nM de este compuesto para inhibir la actividad de S6K1 en ~90%. Este químico a 100-300 nM también inhibe completamente la fosforilación de S6K1 y la proteína S6 inducida por aminoácidos. Similar a S6K1, inhibe la fosforilación de mTORC1 en Ser²⁴⁴⁸ y mTORC2 en Ser²⁴⁸¹ de manera dependiente de la dosis y el tiempo. En presencia de suero o tras la estimulación con IGF1, este compuesto induce una inhibición dependiente de la dosis de la actividad y fosforilación de Akt en Ser⁴⁷³ e inesperadamente en Thr³⁰⁸, así como la fosforilación de los sustratos de Akt PRAS40 en Thr²⁴⁶, GSK3α/GSK3β en Ser²¹/Ser⁹ y Foxo-1/3a en Thr²⁴/Thr³². Este compuesto, pero no la rapamicina, inhibe la actividad de SGK1 y la fosforilación de Ser⁴²², así como su sustrato fisiológico NDGR1 de manera dependiente de la dosis, en la misma medida que la fosforilación de S6K1 y Akt, mientras que no inhibe la fosforilación de ERK o RSK inducida por éster de forbol y la activación de RSK. En comparación con la rapamicina, este químico exhibe una potencia más significativa para inducir la desfosforilación completa de 4E-BP1 en Thr³⁷, Thr⁴⁶ y Ser⁶⁵. Inhibe el crecimiento celular tanto de MEFs de tipo salvaje como deficientes en mLST8 e induce una detención del ciclo celular en G1, de manera más significativa que la rapamicina. [1]

Ku0063794 inhibe el crecimiento tumoral y la señalización de mTOR en un modelo preclínico de carcinoma de células renales. Sin embargo, este compuesto no fue más eficaz en el estudio animal. Una posible explicación de la falta de una mayor actividad in vivo para este químico[2].

• Ensayos de quinasas de complejos mTOR

  Las células HEK-293 se lisan frescas en tampón de lisis Hepes. El lisado (1-4 mg) se pre-clarifica incubando con 5-20 μL de Proteína G-Sepharose conjugada a IgG preinmune. Los extractos de lisado se incuban luego con 5-20 μL de Proteína G-Sepharose conjugada a 5-20 μg de anticuerpo anti-Rictor o anti-Raptor, o IgG preinmune. Todos los anticuerpos están conjugados covalentemente a Proteína G-Sepharose. Las inmunoprecipitaciones se realizan durante 1 hora a 4 °C en una plataforma vibratoria. Los inmunoprecipitados se lavan cuatro veces con tampón de lisis Hepes, seguido de dos lavados con tampón de quinasa Hepes. Para los inmunoprecipitados de Raptor utilizados para fosforilar S6K1, para los dos pasos de lavado iniciales el tampón incluye 0.5 M de NaCl para asegurar una actividad quinasa óptima. La GST-Akt1 se aísla de células HEK-293 privadas de suero incubadas con PI-103 (1 μM durante 1 hora). La GST-S6K1 se purifica de células HEK-293 privadas de suero incubadas con rapamicina (0.1 μM durante 1 hora). Las reacciones de mTOR se inician añadiendo 0.1 mM de ATP y 10 mM de MgCl₂ en presencia de varias concentraciones de KU-0063794 y GST-Akt1 (0.5 μg) o GST-S6K1 (0.5 μg). Las reacciones se realizan durante 30 minutos a 30 °C en una plataforma vibratoria y se detienen añadiendo tampón de muestra SDS. Las mezclas de reacción se filtran a través de un filtro Spin-X de 0.22 μm de tamaño de poro y las muestras se someten a electroforesis y análisis de inmunotransferencia con los anticuerpos indicados.

• Líneas celulares

  Wild-type and mLST8 deficient MEFs

• Concentraciones

  Dissolved in DMSO, final concentration ~3 μM

• Tiempo de incubación

  24, 48, and 72 hours

• Método

  Cells are treated with KU-0063794 for 24, 48, and 72 hours, and the medium is changed every 24 hours with freshly dissolved this compound. For the measurement of cell growth, cells are washed once with PBS, and fixed in 4% (v/v) paraformaldehyde in PBS for 15 minutes. After washing once with water, the cells are stained with 0.1% Crystal Violet in 10% ethanol for 20 minutes and washed three times with water. Crystal Violet is extracted from cells with 0.5 mL of 10% (v/v) ethanoic (acetic) acid for 20 minutes. The eluate is then diluted 1:10 in water and absorbance at 590 nm is quantified. For the assessment of cell cycle distribution, cells are harvested by trypsinization, washed once in PBS, and re-suspended in ice-cold aq. 70% (v/v) ethanol. Cells are washed twice in PBS plus 1% (w/v) BSA and stained for 20 minutes in PBS plus 0.1% (v/v) Triton X-100 containing 50 g/mL propidium iodide and 50 g/mL RNase A. The DNA content of cells is determined using a FACSCalibur flow cytometer and CellQuest software. Red fluorescence (585 nm) is acquired on a linear scale, and pulse width analysis is used to exclude doublets. Cell-cycle distribution is determined using FlowJo software.

• Modelos animales

  Nu/Nu nude mice

• Dosificaciones

  8 mg/kg

• Administración

  i.p.