Flavopiridol (Alvocidib, HMR-1275)

Para el ensayo de quinasa CDK1/ciclina B1, las reacciones de quinasa consisten en 100 ng del complejo GST-CDK1/ciclina B1 (humano) expresado por baculovirus, 1 μg de histona HI, 0.2 μCi de [γ-³³P]ATP, 25 μM de ATP en 50 μL de tampón de quinasa (50 mM Tris, pH 8.0, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 0.5 mM DTT). Para el ensayo de quinasa CDK2/ciclina E, las reacciones de quinasa consisten en 5 ng del complejo GST-CDK2/ciclina E (humano) expresado por baculovirus, 0.5 μg de proteína de fusión GST-RB (aminoácidos 776-928 de la proteína del retinoblastoma), 0.2 μCi de [γ-³³P]ATP, 25 μM de ATP en 50 μL de tampón de quinasa (50 mM Hepes, pH 8.0, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 2 mM DTT). Para el ensayo de quinasa CDK4/ciclina D1, las reacciones de quinasa consisten en 150 ng de GST-CDK4/ciclina D1 (humano) expresado por baculovirus, 280 ng de Stag-ciclina D1, 0.5 μg de proteína de fusión GST-RB (aminoácidos 776-928 de la proteína del retinoblastoma), 0.2 μCi de [γ-³³P]ATP, 25 μM de ATP en 50 μL de tampón de quinasa (50 mM Hepes, pH 8.0, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 2 mM DTT). Las reacciones se incuban durante 45 minutos para CDK1 y CDK2, o 1 hora para CDK4 a 30 °C y se detienen con la adición de ácido tricloroacético (TCA) frío a una concentración final del 15 %. Los precipitados de TCA se recogen en placas unifilter GF/C utilizando un recolector universal Filtermate y los filtros se cuantifican utilizando un contador de centelleo líquido de 96 pocillos TopCount. Flavopiridol (Alvocidib) se disuelve a 10 mM en dimetilformamida (DMF) y se evalúa en seis concentraciones, cada una por triplicado. La concentración final de DMF en el ensayo = 2 %. Los valores de IC50 se derivan mediante análisis de regresión no lineal y tienen un coeficiente de variación = 16 %. Para ensayar su actividad sobre CDK6, se establece un ensayo de unión por filtro. Los siguientes componentes se combinan en la mezcla de reacción: 2 μL de CDK6 (0.7 mg/μL), 5 μL de histona H1 (6 mg/mL), 14 μL de tampón de quinasa (60 mM β-glicerofosfato, 30 mM p-nitrofenil fosfato, 25 mM MOPS (pH 7.0), 5 mM EGTA, 15 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0.1 mM Na-vanadato), 3 μL de concentraciones crecientes de este compuesto diluidas en 50 % de DMSO, y 6 μL de ³³P-ATP (1 mCi/mL) en ATP no radiactivo a una concentración de 90 μM (concentración final: 15 μM). El ensayo se inicia con la adición de ³³P-ATP. La reacción se incuba durante 20 minutos a 30 °C. Una alícuota de 25 μL del sobrenadante se aplica luego sobre papel de fosfocelulosa Whatman P81. Los filtros se lavan 5 veces con una solución de ácido fosfórico al 1 %. Los filtros húmedos se cuentan en presencia de 1 mL de líquido de centelleo. La actividad de Cdk9 se mide utilizando 50 nM de Cdk9/ciclina T recombinante en 50 mM HEPES pH 7.5, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 3 μM Na₃VO₄, 150 μM de péptido CDT de ARN polimerasa y 80 μM de ATP. El ensayo de Cdk7 se realiza en el mismo tampón utilizando 37 nM de quinasa purificada en presencia de 200 μM de ATP y 10 μM de proteína de unión a mielina como sustrato. La potencia de este compuesto hacia CDK9 y CDK7 se determina utilizando un ensayo basado en un intercambiador aniónico fuerte (resina Dowex 1-X8, forma formato) o un ensayo de proximidad por centelleo. Los valores de IC50 se calculan a partir de las curvas de dosis-respuesta.

MCF-7, LNCAP, PC3, HCT116, CACO-2, A549, HL60, K562 cells and et al.

Dissolved in DMSO, final concentrations ~10 μM

72 hours

Cells are exposed to various concentrations of Flavopiridol (Alvocidib) for 72 hours, at which time the tetrazolium dye, MTS in combination with phenazine methosulfate, is added. After 3 hours, the absorbency is measured at 492 nm, which is proportional to the number of viable cells. The results are expressed as IC50 values. For cell cycle analysis, cells are fixed in paraformaldehyde and ethanol, washed, resuspended in a staining solution of TdT enzyme and FITC-dUTP, washed, stained with PI following RNase treatment, and then analyzed by flow cytometry.

Female Balb/c×DBA/2J F1 mice inoculated ip with P388 ascites leukemic cells, and Balb/c nu/nu nude mice subcutaneous implanted with A2780, Br-cycE, or A431 cells

~7.5 mg/kg/day

Injection i.p.