Enzastaurin

La aplicación de Enzastaurin produce una marcada inhibición dependiente de la dosis del crecimiento en todas las líneas celulares de MM investigadas, incluidas MM.1S, MM.1R, RPMI 8226 (RPMI), RPMI-Dox40 (Dox40), NCI-H929, KMS-11, OPM-2 y U266, con una IC50 de 0,6 a 1,6 μM. Este compuesto tiene un impacto directo en las células tumorales humanas, induciendo apoptosis y suprimiendo la proliferación en células tumorales cultivadas. También suprime la fosforilación de GSK3β^ser9, la proteína ribosomal S6S240/244 y AKTThr308, sin tener un efecto directo sobre la fosforilación del VEGFR. [1] Este químico aumenta la apoptosis en linfocitos malignos de CTCL. Cuando se combinó con inhibidores de GSK3, demostró una mejora de los niveles de citotoxicidad. El tratamiento con una combinación de este compuesto y el inhibidor de GSK3 AR-A014418 condujo a un aumento de los niveles de proteína total de β-catenina y de la transcripción mediada por β-catenina. El bloqueo de la transcripción mediada por β-catenina o la reducción de la β-catenina mediante ARN en horquilla pequeño (shRNA) indujeron los mismos efectos citotóxicos que los de este más AR-A014418. Además, el tratamiento con este y AR-A014418 disminuyó los niveles de ARNm y la expresión en superficie de CD44. [2]

El tratamiento de xenoinjertos con Enzastaurin y radiación produjo mayores reducciones en la densidad de microvasos que cualquiera de los tratamientos solos. La disminución en la densidad de microvasos correspondió a un retraso en el crecimiento tumoral. [3]

• Ensayos de inhibición de quinasa

  La inhibición de la actividad de PKCβII, PKCα, PKCε o PKCγ por Enzastaurin se determina utilizando un formato de ensayo de placa de filtro que mide la incorporación de ³³P en el sustrato de proteína básica de mielina. Las reacciones se realizan en volúmenes de reacción de 100 μL en placas de poliestireno de 96 pocillos con las siguientes condiciones finales: 90 mM HEPES (pH 7,5), 0,001 % Triton X-100, 4 % DMSO, 5 mM MgCl₂, 100 μM CaCl₂, 0,1 mg/mL de fosfatidilserina, 5 μg/mL de diacetil glicerol, 30 μM ATP, 0,005 μCi/μL ³³ATP, 0,25 mg/mL de proteína básica de mielina, diluciones seriadas de este compuesto (1-2 000 nM) y enzimas humanas recombinantes PKCβII, PKCα, PKCε o PKCγ (390, 169, 719 o 128 pM, respectivamente). Las reacciones se inician mediante la adición de la enzima y se incuban a temperatura ambiente durante 60 minutos. Luego se detienen con 10 % H₃PO₄, se transfieren a placas de filtro de 96 pocillos de fosfocelulosa aniónica multiscreen, se incuban durante 30 a 90 minutos, se filtran y se lavan con 4 volúmenes de 0,5 % H₃PO₄ en un colector de vacío. Se añade un cóctel de centelleo y las placas se leen en un contador de centelleo Microbeta. Los valores de IC50 se determinan ajustando una ecuación logística de tres variables a los datos de dosis-respuesta de 10 puntos usando ActivityBase 4.0.

• Líneas celulares

  HCT116 and U87MG cells

• Concentraciones

  0.3-4 μM

• Tiempo de incubación

  72 hours

• Método

  Induction of apoptosis by enzastaurin is measured by nucleosomal fragmentation and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick-end labeling (TUNEL) and staining in HCT116 and U87MG cell lines. Briefly, 5 × 10³ cells are plated per well in 96-well plates (1% FBS-supplemented media conditions), incubated with or without this compound for 48 to 72 hours. The absorbance values are normalized to those from control-treated cells to derive a nucleosomal enrichment factor at all concentrations as per the manufacturer's protocol. The concentrations studied ranges from 0.1 to 10 μM. In situ TUNEL staining is assayed with the In situ Cell Death Detection. Cells (7.5 ?10⁴) are plated per well in 6-well plates and incubated 72 hours in 1% FBS-supplemented media ?this chemical. labeled DNA strand breaks are detected with the BD epics flow cytometer. Ten thousand, single-cell, FITC-staining events are collected for each test.

• Modelos animales

  Athymic nude mice; Mouse besring human MM tumors

• Dosificaciones

  75 mg/kg twice daily; 30 mg/kg twice daily

• Administración

  By gavage