Dovitinib (TKI-258)

Dovitinib (TKI-258) inhibe potentemente el crecimiento estimulado por FGF de células B9 que expresan WT y F384L-FGFR3 con una IC50 de 25 nM. Además, inhibe la proliferación de células B9 que expresan cada una de las diversas mutantes activadas de FGFR3. Curiosamente, se observan diferencias mínimas en la sensibilidad de las diferentes mutaciones de FGFR3 a este compuesto, con la IC50 que oscila entre 70 y 90 nM para cada una de las diversas mutaciones. Las células B9 dependientes de IL-6 que contienen solo el vector (células B9-MINV) son resistentes a su actividad inhibidora en concentraciones de hasta 1 µM. Inhibe la proliferación celular de células KMS11 (FGFR3-Y373C), OPM2 (FGFR3-K650E) y KMS18 (FGFR3-G384D) con una IC50 de 90 nM (KMS11 y OPM2) y 550 nM, respectivamente. El compuesto inhibe la fosforilación de ERK1/2 mediada por FGF e induce citotoxicidad en células primarias de MM que expresan FGFR3. Las BMSCs confieren un modesto grado de resistencia con una inhibición del crecimiento del 44,6 % para las células tratadas con 500 nM de Dovitinib y cultivadas en estroma en comparación con una inhibición del crecimiento del 71,6 % para las células cultivadas sin BMSCs. Inhibe la proliferación de M-NFS-60, una línea celular mieloblástica de ratón impulsada por el crecimiento de M-CSF con una concentración efectiva mediana (EC50) de 220 nM. [1] El tratamiento de células SK-HEP1 con este compuesto resulta en una reducción dosis-dependiente del número de células y un arresto en fase G2/M con reducción en las fases G0/G1 y S, inhibición del crecimiento independiente del anclaje y bloqueo de la motilidad celular inducida por bFGF. La IC50 para este compuesto en células SK-HEP1 es aproximadamente de 1,7 µM. También reduce significativamente los niveles de fosforilación basal de FGFR-1, el sustrato 2α de FGFR (FRS2-α) y ERK1/2, pero no de Akt, tanto en células SK-HEP1 como en 21-0208. En células HCC 21-0208, inhibe significativamente la fosforilación inducida por bFGF de FGFR-1, FRS2-α, ERK1/2, pero no de Akt. [2]

Dovitinib (TKI-258) induce respuestas tanto citostáticas como citotóxicas in vivo, lo que resulta en la regresión de tumores que expresan FGFR3.[1] Muestra una inhibición dosis y exposición-dependiente de los receptores tirosina quinasas (RTKs) diana expresados en xenoinjertos tumorales. Este compuesto inhibe potentemente el crecimiento tumoral de seis líneas de HCC. La inhibición de la Angiogenesis se correlacionó con la inactivación de las vías de señalización FGFR/PDGFRβ/VEGFR2. En un modelo ortotópico, inhibe potentemente el crecimiento tumoral primario y la metástasis pulmonar y prolonga significativamente la supervivencia de los ratones. [2] La administración de Dovitinib resulta en una inhibición significativa del crecimiento tumoral y regresiones tumorales, incluyendo tumores grandes y establecidos (500-1.000 mm³). [3]

• Ensayos de quinasa in vitro

  Los valores de concentración inhibitoria al 50 % (IC50) para la inhibición de RTKs por Dovitinib (TKI-258) se determinan en un formato de fluorescencia resuelta en el tiempo (TRF) o radiactivo, midiendo su inhibición de la transferencia de fosfato a un sustrato por la enzima respectiva. Los dominios quinasa de FGFR3, FGFR1, PDGFRβ y VEGFR1-3 se ensayan en 50 mM HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N′-2-etanosulfónico), pH 7.0, 2 mM MgCl₂, 10 mM MnCl₂, 1 mM NaF, 1 mM ditiotreitol (DTT), 1 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA), 0,25 μM de péptido sustrato biotinilado (GGGGQDGKDYIVLPI) y 1 a 30 μM de adenosín trifosfato (ATP) dependiendo del K_m para la enzima respectiva. Las concentraciones de ATP están en o justo por debajo del K_m. Para las reacciones de c-KIT y FLT3, el pH se eleva a 7.5 con 0,2 a 8 μM de ATP en presencia de 0,25 a 1 μM de péptido sustrato biotinilado (GGLFDDPSYVNVQNL). Las reacciones se incuban a temperatura ambiente durante 1 a 4 horas y el péptido fosforilado se captura en placas de microtitulación recubiertas de estreptavidina que contienen tampón de detención de reacción (25 mM EDTA [ácido etilendiaminotetraacético], 50 mM HEPES, pH 7.5). El péptido fosforilado se mide con el sistema DELFIA TRF utilizando un anticuerpo antifosfotirosina PT66 marcado con europio. La concentración de este compuesto para IC50 se calcula utilizando regresión no lineal con el software de análisis de datos XL-Fit versión 4.1 (IDBS). La inhibición de la actividad quinasa del receptor del factor estimulante de colonias-1 (CSF-1R), PDGFRα, receptor de insulina (InsR) y receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGFR1) se determina a concentraciones de ATP cercanas al K_m para ATP.

• Líneas celulares

  B9 cells, MM cell lines

• Concentraciones

  100 nM

• Tiempo de incubación

  48-96 hours

• Método

  Cell viability is assessed by 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyl tetrazolium (MTT) dye absorbance. Cells are seeded in 96-well plates at a density of 5 × 10³ (B9 cells) or 2 × 10⁴ (MM cell lines) cells per well. Cells are incubated with 30 ng/mL aFGF and 100 μg/mL heparin or 1% IL-6 where indicated and increasing concentrations of Dovitinib (TKI-258). For each concentration of this compound, 10 μL aliquots of drug or DMSO diluted in culture medium is added. To evaluate its effect on growth of MM cells adherent to BMSCs, 10⁴ KMS11 cells are cultured on BMSC-coated 96-well plates in the presence or absence of it. Plates are incubated for 48 to 96 hours. For assessment of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)-mediated growth, 5 × 10³ M-NFS-60 cells/well are incubated with serial dilutions of it with 10 ng/mL M-CSF and without granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). After 72 hours cell viability is determined using Cell Titer-Glo Assay. Each experimental condition is performed in triplicate.

• Modelos animales

  8-week-old female BNX mice bearing KMS11 cells

• Dosificaciones

  10, 30, or 60 mg/kg

• Administración

  Gavage