Belinostat (PXD101)

Los cultivos subconfluentes se cosechan y se lavan dos veces en PBS frío y se pelletizan por centrifugación a 200 × g durante 5 min. El pellet celular se resuspende en dos volúmenes de tampón de lisis [tampón Tris 60 mM (pH 7,4) que contiene 30% de glicerol y 450 mM de NaCl] y se lisa mediante tres ciclos de congelación (hielo seco) y descongelación (baño de agua a 30 °C). Los restos celulares se eliminan por centrifugación a 1,2 × 10⁴ g durante 5 min, y el sobrenadante se almacena a −80 °C. El péptido de histona H4 (secuencia SGRGKGGKGLGKGGAKRHRK correspondiente a los 20 residuos NH2-terminales) se acetila mediante una proteína recombinante que contiene el dominio hipoxantina-aminopterina-timidina de p300, utilizando [³H]acetil CoA como fuente de acetato. El péptido H4 (100 μg) se mezcla con tampón de hipoxantina-aminopterina-timidina (50 mM Tris HCl pH 8,0, 5% glicerol, 50 mM KCl y 0,1 mM EDTA), 1 mM DTT, 1 mM 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilfluoruro, 1 × inhibidores de proteasa completos, 50 μL de p300 purificada y 1,85 m [³H]acetil CoA (4,50 Ci/mmol) en un volumen final de 300 μL y se incuba a 30 °C durante 45 min. La proteína p300 se elimina por incubación con 20 μL de perlas de Ni-agarosa al 50% durante 1 hora a 4 °C y centrifugación. El sobrenadante se aplica a una columna de Sephadex G15 de 2 mL, y se recoge el flujo pasante. Se aplica suavemente un mililitro de H₂O destilada, y se recogen fracciones de tres gotas; esto se repite hasta que se hayan añadido 4–5 mL de H₂O destilada, y se recogen ~40 fracciones. Tres microlitros de cada fracción se diluyen en 2 mL de líquido de centelleo y se cuentan en un contador de centelleo para identificar las fracciones que contienen el péptido marcado. Estas fracciones se agrupan, y se mide 1 μL de la muestra combinada para evaluar la radioactividad en cada lote de péptido (3-7×10³ cpm/μL). Para los ensayos de actividad, la reacción se lleva a cabo en un volumen total de 150 μL de tampón [60 mM Tris (pH 7,4) que contiene 30% de glicerol] que contiene 2 μL de extracto celular y, cuando se utiliza, 2 μL de este compuesto. La reacción se inicia con la adición de 2 μL de sustrato marcado con [³H] (péptido de histona H4 acetilado correspondiente a los 20 residuos NH₂-terminales). Las muestras se incuban a 37 °C durante 45 min, y la reacción se detiene con la adición de HCl y ácido acético (concentraciones finales de 0,72 y 0,12 M, respectivamente). El [³H]acetato liberado se extrae en 750 μL de acetato de etilo, y las muestras se centrifugan a 1,2 × 10⁴ g durante 5 min. La fase superior (600 μL) se transfiere a 3 mL de líquido de centelleo y se cuenta.

A2780, A2780/cp70, 2780AD, HCT116, HT29, WIL, CALU-3, MCF7, PC3 and HS852

0.016 - 10 μM

24 hours

Tumor cell lines are seeded in 5 mL of medium at a density of 8 × 10⁴ cells/25 cm2 flask and incubated for 48 hours. Cells are exposed to Belinostat (0.016 to 10 μM) for 24 hours. The medium is removed, and 1 mL of trypsin/EDTA is added to each flask. Once the cells have detached, 1 mL of medium is added, the cells are resuspended, and those from the control untreated flask are counted. Cells are diluted and plated into 6-cm Petri dishes (three per flask) at a density of 0.5-2× 10³ cells/dish depending on the cell line. Cells from the drug-treated flasks are diluted and plated as for the control flasks. Dishes are incubated for 10–15 days at 37 °C. Cells are washed with PBS, fixed in methanol, and stained with crystal violet, and colonies that contained ≥50 cells counted. Sensitivity is expressed as the IC50 defined as the concentration of this compound required to reduce the number of colonies to 50% of that of the control untreated cells.

A2780, A2780/cp70 and HCT116 cells are injected s.c. into the right flank of CD1 nu/nu mice.

≤40 mg/kg

Administered via i.p.