3-Methyladenine (3-MA)

La ligera preferencia por la prevención de Vps34 por la 3-Methyladenine (3-MA) probablemente surge de un anillo hidrofóbico específico de Vps34, que rodea el grupo 3-metilo de este compuesto. [1] Se ha informado que causa la muerte de células cancerosas tanto en condiciones normales como de inanición, y también podría suprimir la migración e invasión celular independientemente de su capacidad para inhibir la Autophagy, lo que implica que posee funciones distintas de la supresión de la Autophagy. Este compuesto provoca la muerte celular dependiente de caspasa que es independiente de la inhibición de la Autophagy. El tratamiento con 5 mM de este compuesto reduce el porcentaje de células HeLa privadas de glucosa que muestran puntos GFP-LC3 al 23%. Los niveles de LC3-I aumentan y los niveles de LC3-II disminuyen entre 12 y 48 horas en células tratadas con 3-MA. La conversión de LC3-I a LC3-II es suprimida por el compuesto. El tratamiento de células HeLa con 2,5 mM o 5 mM durante un día no afecta la viabilidad celular, mientras que el tratamiento con 10 mM durante un día causa una disminución del 25,0% en la viabilidad celular. El tratamiento de células con 2,5, 5 o 10 mM durante dos días causa una disminución del 11,5%, 38,0% y 79,4% en la viabilidad, respectivamente. Disminuye la viabilidad celular de forma dependiente del tiempo y la dosis, y acorta significativamente la duración de la detención de la prometafase inducida por nocodazol. [2] La supresión de la Autophagy por 3-MA inhibe la muerte celular inducida por SU11274. [3] El tratamiento prolongado con este compuesto (hasta 9 horas) induce una conversión significativa de LC3 I a II en MEF de tipo salvaje. El tratamiento prolongado con 3-MA, pero no con wortmannin, aumenta notablemente la puntuación/agregación de GFP-LC3. Su conversión de LC3 inducida y la liberación de GFP libre son dependientes de ATG7. El tratamiento con este compuesto conduce a un aumento evidente del nivel de proteína p62. El compuesto aumenta el nivel de p62 incluso en MEF Atg5-/-- así como en células con deleción de ATG5 mediada por DOX. Inhibe la PI3K de clase I y clase III en diferentes patrones temporales. Su conversión de LC3 I a LC3 II inducida está dramáticamente comprometida en células Tsc2-/-- en comparación con células de tipo salvaje. Este compuesto interrumpe la función anti-autofágica del complejo mTOR 1. [4]

La 3-Methyladenine (3-MA) bloquea la Autophagy a través de su efecto sobre la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) de clase III. El tratamiento con este compuesto no altera el grado de hemorragia en comparación con el grupo de hemorragia subaracnoidea (HSA). Su pretratamiento agrava significativamente los síntomas neurológicos en comparación con el grupo HSA + vehículo. La Autophagy disminuye cuando se aplica. Por el contrario, la caspasa-3 escindida está marcadamente regulada al alza en el grupo HSA + 3-MA. En línea con la regulación al alza de la expresión de la caspasa-3 escindida, el número de células TUNEL-positivas en el córtex derecho aumenta significativamente en el grupo HSA + 3-MA en comparación con el grupo HSA + vehículo. [5]

• Ensayo de degradación de proteínas

  Las células HeLa se radiomarcan durante 24 horas con 0,05 mCi/mL de l-[U- ¹⁴C]valina. Al final del período de marcado, las células se enjuagan tres veces con PBS. Las células se incuban durante los tiempos designados en medio completo o EBSS con o sin la presencia de 10 mM de 3-Methyladenine (3-MA).

• Líneas celulares

  HeLa cell line

• Concentraciones

  1-10 mM

• Tiempo de incubación

  24, 48 or 72 hours

• Método

  After treatment with 3-Methyladenine (3-MA), cell (such as HeLa cell) viability is determined by a trypan blue exclusion assay. Briefly, both adherent and floating cells are collected and suspended in phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) at a final density of 1-2 × 10⁶/mL. An equal volume of 0.4% trypan blue solution (w/v, in PBS) is added to the cell suspension and mixed thoroughly. After incubation at room temperature for 3 min, cell counting is performed using a hemacytometer.

• Modelos animales

  Adult male Sprague–Dawley rats weighing 300-350 g

• Dosificaciones

  400 nM

• Administración

  Intracerebral ventricular