NVP-BSK805 2HCl JAK Inhibidor

Se ha descubierto que NVP-BSK805 inhibe potentemente JAK2, mostrando una selectividad superior a 20 veces hacia JAK1, JAK3 y TYK2. NVP-BSK805 provoca una inhibición semimáxima de las enzimas JAK2^V617F de longitud completa y JAK2 de tipo salvaje a 0,5 nM. NVP-BSK805 bloquea el crecimiento de células JAK2^V617F (Ba/F3) e induce la apoptosis con un GI50 a concentraciones <100 nM. Dado que la fosforilación constitutiva de STAT5 depende de JAK2, se ha descubierto que NVP-BSK805 suprime potentemente la fosforilación de STAT5 a concentraciones ">= 100 nM en las líneas celulares mutantes JAK2^V617F, como MB-02. La incubación de células SET-2 con 150 nM y 1 µM de NVP-BSK805, lo que corresponde a concentraciones que producen una inhibición del crecimiento del 75 % y el 95 %, respectivamente, durante 24, 48 y 72 horas, conduce a una inducción de la apoptosis dependiente de la concentración y el tiempo. Estos resultados se evidencian por la detección de PARP clivado, la expresión reducida de Bcl-xL y un fuerte aumento en el número de células con menos de 2N de contenido de ADN. [1] La muerte celular desencadenada por NVP-BSK805 requiere la activación de cascadas de caspasas y se supera mediante la inhibición de las caspasas tanto en células SET-2 como en MB-02. NVP-BSK805 modula la modificación postraduccional de Bim y los niveles de Mcl-1 en células JAK2^V617F, células SET-2 y MB-02. [2]

Ensayos enzimáticos

El dominio cinasa humano JAK2 (aminoácidos 840-1132) está contenido en el constructo plasmídico pAcG2TtevJAK2. Se diseñan los constructos plasmídicos para JAK3 (813-1124), TYK2 (888-1187) y JAK1 (866-1154). La generación de los baculovirus recombinantes con ADN linealizado BD BaculoGold^TM Bright, el ensayo de placa y la amplificación del virus a partir de placas individuales se realizan según el manual (BD Biosciences Pharmingen). Los dominios de la cinasa Janus se expresan en células Sf9 en matraces de agitación de 400 mL con 100 mL de medio de cultivo ExCell420 (JRH Biosciences Ltd) con solución de penicilina/estreptomicina durante 48 h a 27 °C. Las células de cultivo en suspensión se infectan a una densidad de 1 × 10⁶ y la multiplicidad de infección (MOI) para cada virus se optimiza para el rendimiento de proteína soluble. El dominio cinasa de JAK2 humano y de JAK1, JAK3 y TYK2 se expresa a un MOI de 1 y 0,5, respectivamente. El tiempo de expresión a 27 °C es de 48 horas para JAK2 y de 48 horas o 72 horas para JAK1, JAK3 y TYK2. Cuarenta y ocho o setenta y dos horas después de la infección, las células de un cultivo de expresión de 100 mL se cosechan por centrifugación a 3000 x g durante 5 minutos y se lisan con 12 mL de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM ortovanadato de sodio, 1 % Triton X-100, 10 % glicerol, 1 x cóctel completo de inhibidores de proteasa sin EDTA (Roche Diagnostics) y 12,5 U/mL Benzonase durante 30 minutos a 4 °C, seguido de centrifugación a 14 000 × g durante 45 minutos para pelletar el material insoluble. Para la purificación por afinidad con etiqueta GST de las proteínas del dominio cinasa, todos los pasos se realizan a 4 °C. Los lisados clarificados se incuban con 0,2 mL de una suspensión al 50 % de glutatión sefarosa 4B lavada durante 2 horas a 4 °C, seguido de 5 lavados con 1 mL de 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT y 10 % glicerol. La proteína unida se eluye en 5 alícuotas, cada una comenzando con una incubación de 10 minutos con 0,25 mL de tampón de elución (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT, 10 % glicerol, 10 mM L-glutatión reducido). Los eluidos se concentran aproximadamente 5 veces con columnas de centrifugación Amicon Ultra-4. Después de la adición de Brij35 a una concentración final del 0,1 %, la proteína se congela rápidamente en pequeñas alícuotas y se almacena a -80 °C. En estas condiciones, las actividades cinasas son estables durante al menos 6 meses. Las enzimas del dominio cinasa JAK se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente en un medio que contiene 0,1 μM [γ³³P]-ATP, 1 mM MnCl₂, 5 mM MgCl₂, 30 μM de sustrato peptídico sintético EQEDEPEGDYFEWLE, 1 mM DTT, 1 % DMSO, 50 μg/mL BSA, 0,01 % Brij35 y 50 mM Tris-HCl pH 7,5. La concentración de ATP está por debajo del Km para todas las proteínas. Las curvas se ajustan mediante regresión no lineal utilizando la ecuación logística y la función de ajuste global de XLfit® (modelo 205). La expresión y caracterización de JAK2 de tipo salvaje de longitud completa y mutante V617F, así como las condiciones del ensayo cinasa, se han descrito en otros lugares. La selectividad cinasa de NVP-BSK805 se evalúa en un panel cinasa interno: En los ensayos Caliper, las reacciones cinasas se llevan a cabo con sustratos peptídicos que migran con diferentes velocidades en un campo eléctrico cuando están fosforilados. Los péptidos llevan una etiqueta fluorescente para permitir la detección y cuantificación de los péptidos en un sistema capilar. Las intensidades de fluorescencia de los péptidos se cuantifican utilizando el instrumento LC3000 (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, EE. UU.). La actividad cinasa se mide cuantificando la cantidad de ATP que queda en solución después de una reacción cinasa. En los ensayos cinasa LanthaScreen™ TR-FRET, se utiliza terbio como quelato de lantánido combinado con un anticuerpo dirigido contra el sustrato fosforilado.

La biodisponibilidad oral de NVP-BSK805 en ratones se estima en un 45 %, mientras que en ratas es del 50 %. La administración oral de NVP-BSK805 a 150 mg/kg suprime la fosforilación de STAT5, la esplenomegalia y la propagación de células leucémicas en un modelo de ratón impulsado por células Ba/F3 JAK2^V617F. NVP-BSK805 suprime la fosforilación de STAT5 inducida por rhEpo, así como la policitemia y la esplenomegalia mediadas por rhEpo en ratones BALB/c a dosis orales de 25, 50 y 100 mg/kg. [1]