AT9283

AT9283 leidt tot een duidelijk polyploïd fenotype door de activiteit van Aurora B kinase in HCT116-cellen te remmen met een IC50 van 30 nM. Bovendien produceert deze verbinding ook een krachtige remming van de HCT116-kolonievorming. [1]

Bij HCT116 humane colorectale carcinoom xenograft dragende muizen, resulteert AT9283-behandeling (15 mg/kg en 20 mg/kg) gedurende 16 dagen in een significante tumorremming van respectievelijk 67% en 76%. Bovendien vertoont deze verbinding ook een significant langere halfwaardetijd in tumoren (2,5 uur) vergeleken met plasma (0,5 uur) en een bescheiden orale biologische beschikbaarheid bij muizen (Fp.o. = 24%). [1]

• Aurora A en Aurora B Kinase Assays

  Assays voor Aurora A en B worden uitgevoerd in een DELFIA-formaat. Het Aurora A-enzym wordt geïncubeerd met AT9283 en 3 μM cross-tide substraat (biotine-CGPKGPGRRGRRRTSSFAEG) in 10 mM MOPS, pH 7, 0,1 mg/mL BSA, 0,001% Brij-35, 0,5% glycerol, 0,2 mM EDTA, 10 mM MgCl₂, 0,01% β-mercapto-ethanol, 15 μM ATP en 2,5% DMSO. Het Aurora B-enzym wordt geïncubeerd met deze verbinding, 3 μM van het bovengenoemde substraat in 25 mM Tris, pH 8,5, 5 mM MgCl₂, 0,1 mg/mL BSA, 0,025% Tween-20, 1 mM DTT, 15 μM ATP en 2,5% DMSO. De reacties worden 60 minuten en 45-90 minuten, respectievelijk voor Aurora A en Aurora B, voortgezet alvorens te quenchen met EDTA. De reactiemengsels worden vervolgens overgebracht naar een neutravidine-gecoate plaat en het gefosforyleerde peptide wordt gekwantificeerd door middel van een fosfo-specifieke antilichaam en een met europium gelabeld secundair antilichaam met behulp van tijd-opgeloste fluorescentie (excitatie, 337 nm; emissie, 620 nm). IC50-waarden voor de controleverbindingen zijn 92 nM (Aurora A-assay) en 17 nM (Aurora B).

• Cellijnen

  HCT 116 cells

• Concentraties

  1 nM - 10 μM

• Incubatietijd

  72 hours

• Methode

  HCT 116 cells are cultured in DMEM + 10% FBS + GLUTAMAX I. Black 96-well flat-bottomed (clear) tissue culture treated plates are seeded in 200 μL of medium and incubated for approximately 16 hours at 37°C in a humidified atmosphere of 5% CO₂ in air. Cells are treated with test compound at nine different concentrations (spanning 1 nM to 10 μM, plus DMSO vehicle control) and then incubated for 72 hours. Polyploidy morphological observations of the cells are then noted. The concentration of AT9283 required to produce a distinct polyploid phenotype is reported. Cells are seeded at a concentration of 75−100 cells/mL relevant culture media onto 6- or 24-well tissue culture plates and allowed to recover for 16 hours. This compound (11 concentrations spanning 0.1 nM to 10 μM) or vehicle control (DMSO) is added to duplicate wells to give a final DMSO concentration of 0.1%. Following compound addition, colonies are allowed to grow between 10 and 14 days for optimum discrete colony counting. Colonies are fixed in 2 mL of Carnoys fixative (25% acetic acid, 75% MeOH) and stained in 2 mL of 0.4% w/v crystal violet. The numbers of colonies in each well is counted. IC50 values are calculated by sigmoidal dose-response (variable slope) IC50 curves using Prism Graphpad software.

• Dierlijke modellen

  HCT116 cells are injected s.c. Into the hind flank of male BALB/c mice.

• Doseringen

  15 mg/kg and 20 mg/kg

• Toediening

  Administered via i.p.