Dyngo-4a (Hydroxy-Dynasore) Dynamin inhibiteur

Dyngo-4a inhibe l'endocytose de la transferrine dépendante de la dynamine dans plusieurs types de cellules avec une IC₅₀ de 5,7 μM, et réduit l'endocytose des vésicules synaptiques et l'endocytose en vrac dépendante de l'activité dans les neurones et synaptosomes en culture. [1] Dans les terminaisons nerveuses motrices et les neurones hippocampiques en culture, ce composé bloque l'internalisation de Alexa Fluor 488-BoNT/A-Hc. [2] Dans les cellules S2R+ de drosophile, il provoque une diminution du niveau d'Armadillo/β-caténine. [3]

Essai de la GTPase Dynamin

L'activité de la dynamin I est mesurée dans son état d'activité SAI ou est stimulée par trois méthodes différentes. Comme chaque stimulus active la dynamin à des degrés différents, chaque essai nécessite des concentrations de dynamin différentes. Premièrement, l'activité maximale de la dynamin est stimulée par des liposomes PS sonicés. La dynamin I purifiée (10–20 nM, diluée dans : 6 mM Tris–HCl, 20 mM NaCl et 0,01 % Tween 80, pH 7,4) est incubée dans des plaques à 96 puits dans un tampon GTPase (5 mM Tris–HCl, 10 mM NaCl, 2 mM Mg²⁺, 0,05 % Tween 80, pH 7,4, 1 µg/mL de leupeptine et 0,1 mM de PMSF) et du GTP 0,3 mM en présence du composé test pendant 30 min à 37°C dans un volume d'essai final de 150 μL. Les réactions sont arrêtées avec 10 μL d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) 0,5 M pH 7,4 et une solution de vert de malachite (40 μL : 2 % p/v de tétrahydrate de molybdate d'ammonium, 0,15 % p/v de vert de malachite et 4 M HCl) est ajoutée pendant 5 min. Deuxièmement, la dynamin (20 nM) est stimulée par 10 µg/mL de microtubules de cerveau bovin préformés stabilisés au taxol en utilisant le même protocole. Troisièmement, la dynamin I (50 nM) est stimulée par 1 μM de grb2 recombinant, une protéine contenant SH3 qui stimule la dynamin environ 5 à 10 fois moins efficacement que les liposomes ou les microtubules. Enfin, l'activité SAI de la dynamin (500 nM) est mesurée en utilisant des concentrations élevées de dynamin, ce qui favorise son auto-assemblage coopératif en anneaux (mais pas en hélices). La concentration finale de DMSO dans les essais GTPase ou d'endocytose est au maximum de 3,3 ou 1 % respectivement, mais est généralement de 1 %. L'essai GTPase pour la dynamin I n'est pas affecté par le DMSO jusqu'à 3,3 %. Les composés sont dissous sous forme de stocks de 30 mM dans 100 % de DMSO. Ces solutions mères peuvent être stockées à -20°C pendant plusieurs mois. Les composés sont ensuite dilués dans des solutions de 50 % de DMSO préparées dans 20 mM Tris–HCl pH 7,4 et à nouveau dilués dans l'essai final. Pour l'analyse de la cinétique de l'inhibition de ce composé, la dynamin I à une concentration finale de 17 nM est incubée avec un tampon GTPase contenant du PS (2 µg/mL) et des quantités variables de GTP (50–250 μM) en présence de ce produit chimique à une gamme de concentration entre 0,5 et 6 μM. La réaction est arrêtée après 30 min par addition d'EDTA (0,5 mM, pH 7,4). Les courbes sont générées à l'aide de l'équation de Michaelis–Menten v = Vmax[S]/(Km + [S]), où S est le substrat GTP. Après la détermination des valeurs Vmax et Km, les données ont été transformées à l'aide de l'équation de Lineweaver–Burke, 1/v = 1/Vmax + (Km/Vmax)(1/[S]). Les conditions d'essai sont basées sur l'essai de la dynamin I mais contiennent des modifications. La dynamin II recombinante est utilisée à 50 nM, stimulée par 10 µg/mL de PS. La réaction GTPase est laissée se produire pendant 90 min à 37°C avant l'arrêt.